組蛋白修飾在酒精成癮中的作用及機制

唐曉歡，鄧媛，顧悅，吳天輝，孟怡然，孫榮基，彭澎

（云南省藥物依賴防治研究所，昆明 650228）

酒精作為一種中樞神經抑制劑，是流行最廣的社會性成癮物質。據世界衛生組織（WHO）發布的《2018年全球酒精與健康狀況報告》指出，2016 年全世界有約300 萬人因有害使用酒精而死亡，占全球死亡總數的5.3%。有害使用酒精與多種疾病和損傷相關，增加意外事故風險，對個人、家庭以及社會都造成了巨大的損失。酒精成癮是一種嚴重的精神疾病，對人體產生多方面的影響。本文從表觀遺傳學的角度對酒精使用及成癮進行綜述，介紹酒精對組蛋白修飾的影響及其作用機制。

1 酒精代謝及成癮過程

酒精是影響大腦發育最重要的神經毒性化合物之一[1]，通過肝臟中的氧化途徑和肝外組織中的非氧化途徑代謝。直接參與酒精代謝的酶是乙醇脫氫酶（ADH）和乙醛脫氫酶（ALDH）[2]，酒精在ADH 的催化下產生乙醛，乙醛是一種高活性毒性分子，對DNA 高度反應，損害染色體和使干細胞發生突變[3]，乙醛隨后在線粒體中代謝為醋酸，并生成高還原性的細胞環境，促進氧化還原反應發生[4]。細胞凋亡是正常的細胞發育過程，可消除異常活躍的神經元，然而，酒精作為N-甲基- D-天冬氨酸（NMDA）受體拮抗劑和γ-氨基丁酸（GABA）激動劑，會在大腦中不恰當地觸發這一過程，在細胞中引發強烈的應激反應[5]，氧化應激除了會引起染色體異常，還會導致酶的功能障礙[3]。神經影像學研究已確認產前酒精暴露會引起腦結構異常，如大腦和小腦體積減少，胼胝體發育不全，海馬體積減少等[5]。

酒精使用障礙（AUDs）是一種慢性復發性腦病[6]，其特征是：①對酒精攝入失去控制；②強迫性使用酒精；③與吸毒有關的行為；④社會和職業問題；⑤渴求感；⑥耐受性和戒斷癥狀[7]。與其他濫用物質相比，酒精的效力較弱，但對谷氨酸、GABA、多巴胺和內源性阿片受體等多種神經系統具有普遍影響[8]，產生中樞系統抑制作用、抗焦慮作用、獎賞作用等。長期慢性使用酒精會使中樞神經系統發生適應性改變，出現依賴、戒斷反應等[9]。Koob 等人提出的酒精成癮“非穩態理論”，指的就是長期和過度的酒精接觸能夠引起大腦功能適應性變化，導致調節系統偏離穩態[10]。

2 表觀遺傳及調節機制

生物體的遺傳信息分為基因型和表型，基因型就是DNA 堿基序列的改變，直接反映在生物體的遺傳信息表達上。表觀遺傳是指不改變DNA 序列，而是對基因調控的影響因子進行結構和功能的修飾，從而改變基因表達[11]。與不靈活的基因組不同，表觀遺傳機制對環境的干擾很敏感，是轉錄的主要調節器[3]，也是單個基因組能產生細胞多樣性的基礎[2]。有研究提示表觀遺 傳修飾可通過種系和多代傳遞[6]，影響生物體的繁殖特性[11]。表觀遺傳修飾極其穩定，這可能是成癮行為長期存在的分子基礎之一。當基因變異不能完全解釋復雜疾病（如AUDs）的所有遺傳現象時，表觀遺傳可能“填補空白”，更好地解釋復雜疾病的遺傳機制[6]。

表觀遺傳調節機制主要有DNA 甲基化、組蛋白修飾、染色質重塑以及非編碼RNA 等[12]。核DNA 和蛋白質之間的復合體叫做染色質，染色質的基本組成單位是核小體，核小體的核心由組蛋白H2A、H2B、H3、H4 各一對組成，周圍圍繞著146 bp 大小的DNA[13]，核小體是真核生物染色質的基本結構，染色質即是由DNA、組蛋白和非組蛋白組成的纖維結構。表觀遺傳機制以環境敏感的方式改變轉錄程序，這些機制不改變DNA 序列而是通過DNA 和組蛋白尾的化學修飾來影響基因表達[14]，并相互協同調控[5]。

3 組蛋白修飾

組蛋白（H）是一種小蛋白質，含有高比例的堿性氨基酸（精氨酸和賴氨酸），有助于與負電荷DNA 分子結合，組蛋白主要有五種亞型：H1、H2A、H2B、H3和H4[1]。每個組蛋白的N-末端氨基酸都能發生大量共價修飾，即組蛋白修飾[15]。組蛋白修飾是控制DNA 修復、復制和轉錄的重要表觀遺傳機制，包括甲基化（精氨酸和賴氨酸殘基）、乙酰化（賴氨酸殘基）、磷酸化（絲氨酸和蘇氨酸殘基）、泛素化、素酰化、adp-核糖化（賴氨酸殘基）和脯氨酸異構化等[4]。不同修飾發生的位點略有不同，與不同的酶催化不同反應相關[16]。組蛋白修飾并不是靜止不動的，而是根據酶的不同調控處于高度動態中[15]，并且不同的修飾方式會產生不同的效果[17]。

3.1 組蛋白乙酰化

乙酰化是組蛋白修飾的主要機制之一[18]，發生在核小體組蛋白核心突出的N 端賴氨酸殘基上。乙酰基的供體是乙酰輔酶A，組蛋白亞基的尾部插入DNA 的小槽中，并通過雙螺旋延伸，參與轉錄激活（乙酰化）或抑制（去乙酰化）。當帶正電荷的氨基酸如賴氨酸，被定位在組蛋白的氨基末端時，添加帶負電荷的乙酰基中和了賴氨酸的電荷，減弱了核小體和組蛋白尾之間的相互作用，打開核小體，使轉錄復合體接觸DNA 模板從而進行基因轉錄。相反，乙酰基的去除使核小體裝配更緊密，阻止了轉錄機制的進入，沉默基因表達[4]。催化這些反應的是組蛋白乙酰化酶（HATs）和去乙酰化酶（HDACs）[19]。HDACs 根據不同亞型的序列相似性和細胞定位又可分為四類：Ⅰ類HDAC（1、2、3、8），Ⅱ類HDAC（4、5、6、7、9、10），Ⅲ類HDAC 也稱為sirtuins，由SIRT 1-7 組成，HDAC11 屬于Ⅳ類[10]。

乙酰化多發生在組蛋白H3 和H4 的特定賴氨酸殘 基 上， 如H3K9、H3K14、H3K18、H4K5、H4K8、H4K12[18，20]。H4K5 和H4K12 乙酰化是記憶相關基因表達的關鍵標記，表觀遺傳機制已被證明在記憶和學習過程中發揮作用。產前和哺乳酒精暴露可引起前額葉皮質（PFC）H4K5 和H4K12 乙酰化水平增加，而在海馬體（HPC）中只有H4K5 乙酰化水平增加，這表明發育性酒精暴露會導致大腦中特定區域的表觀遺傳改變，酒精對組蛋白乙酰化的作用也具有組織、細胞和腦區特異性[4]。此外，PFC 中的H4K5 乙酰化水平與母親飲酒水平相關，表明酒精對H4K5 的乙酰化存在劑量依賴效應。在嚙齒動物模型中，急性乙醇暴露與杏仁核HDAC 活性下降和H3 和H4 乙酰化增加有關，在酒精戒斷期可出現杏仁核HDAC 活性增加和組蛋白去乙酰化，而該腦區HDAC 活性增加、戒斷引起的焦慮行為和神經肽Y（NPY）表達缺陷可通過使用HDAC 抑制劑Trichoatin-a 來糾正[21]，NPY 是一種在杏仁核區域高度表達的神經肽，有證據表明，較高的NPY 水平能減少酒精使用，較低則會促進酒精使用。其他動物研究也表明，使用HDAC 抑制劑和通過siRNA 敲除HDAC 可以改善酒精引起的焦慮和酒精中毒，提示HDAC 抑制劑對AUDs 有治療潛力[6]。MMP-9 是一種明膠酶，已被證實在學習、記憶以及毒品濫用等各種神經可塑性現象中起重要作用，殷麗天等研究發現，HDAC6 可調控 MMP-9 的表達，影響海馬突觸可塑性，最終使小鼠酒精依賴效應增強[22]，Tubastatin A 及其衍生物是已報道活性、選擇性和類藥性最高的HDAC6 抑制劑[23]，具有重要的潛在治療價值。非特異性HDAC 抑制劑丁酸鈉（NaB）能夠預防和逆轉乙醇誘導的行為敏化和基因表達，NaB 的治療顯著減輕了依賴大鼠的過量酒精攝 入[10]。總的來說，HDAC 抑制劑的治療作用是對HDAC 有抑制作用的小分子通過血腦屏障進入中樞神經系統，發揮抗炎和神經保護功能，幫助恢復染色質重塑，改善異常突觸的可塑性，防止焦慮樣行為，增強記憶形成，并且在認知功能減退的神經疾病中也顯示出了很好的治療效果[1]。因此酒精能改變組蛋白的乙酰化水平，而組蛋白的乙酰化水平改變又反過來影響酒精的攝取[22]。

酒精不僅影響腦組織遺傳因子，還對生物體重要器官的生長發育產生關鍵作用，妊娠和哺乳期接觸酒精會明顯改變基因遺傳印跡、神經膠質發育、細胞周期調控和神經系統生長[1]。母親在懷孕期間飲酒可能導致胎兒酒精綜合征[12]，該綜合征中最嚴重的影響之一就是心臟發育畸形。與胎兒心臟發育密切相關的是組蛋白H3[24]，組蛋白乙酰化失衡會導致干細胞心肌樣分化障礙[25]。H3K9 乙酰化對染色質結構、基因表達和細胞凋亡起重要作用，也是基因活化的重要標志之一。心臟的發育過程中有很多轉錄因子參與其中，最關鍵的核心轉錄因子是GATA4 及Mef2c[26]，酒精可能通過干擾 CBP/p300 介導的GATA4 和NKX2.5 啟動子區域H3 乙酰化修飾，引起表突變，CBP/p300 是HATs 家族的重要成員，可以調節染色質結構[4]，核心因子不管是質還是量的輕微改變都會對心臟發育造成嚴重影響。同時H3K9乙酰化的正常時序性也被擾亂，發生轉錄錯誤。彭昌等的研究結果顯示姜黃素可通過抑制CBP/p300 在啟動子區域的結合來降低H3 的高乙酰化，進而下調GATA4、NKX2.5 基因表達水平[27]。酒精不僅通過孕母對胎兒造成影響，孕前父親如果持續大量攝入酒精也會導致胎兒生長發育異常。路倩等就針對父代小鼠飲酒是否會對子代心肌組織生長發育產生影響進行了研究，結果顯示子代小鼠心肌組織中促凋亡蛋白caspase-3 啟動子區域H3K9 乙酰化水平升高，同時抑凋亡因子Bcl-2 相同區域H3K27 乙酰化水平顯著降低[28-29]，提示組蛋白修飾如果發生在不同氨基酸位點，即可動態調控一對相互拮抗基因的轉錄，對基因表達起到不同作用。

3.2 組蛋白甲基化

同乙酰化一樣，組蛋白甲基化也是最具特征、最多的修飾之一[16]。組蛋白甲基化是控制基因表達、干細胞成熟、遺傳印跡和細胞有絲分裂的主要染色質修飾[4]。甲基化多發生在賴氨酸和精氨酸殘基上，包括H3K4、H3K9、H3K27、H3K36、H4K2 等位點[30]。組蛋白甲基化受甲基轉移酶（HMT）和去甲基化酶調控 （KDM）[16]。有超過50 種人類HMT 和約30 種KDM[14]。組蛋白甲基化可以促進或抑制轉錄，這取決于被修飾的特定氨基酸殘基[24]。H3K4 的甲基化通常與基因誘導相關，而H3K27 的甲基化使染色質濃縮，抑制基因表達[14]，如H3K4 二甲基化（H3K4me2）、三甲基化（H3K4me3）和H3K36me3 參與了基因的轉錄和激活，而且這種激活作用在H3K9 和H3K14 乙酰化作用存在時還會得到一定程度的加強[16]。有趣的是，H3K9me2和H3K9me3 與基因激活有關，H3K9 和H3K27 的單甲基化與其二甲基化和三甲基化相比，則以相反的方式調節基因轉錄，這表明修飾的效價在調控染色質結構時也很重要[10]。已有研究表明，急性酒精暴露后，大鼠的HDAC 活性下降，引起H3K4me3 增加，而H3K9me2減少，不止動物實驗，在酒精成癮者NAc 中也觀察到了H3K9me2 減少，而海馬組織中H3K4me3 的水平升高，說明H3K9me2 和H3K4me3 與酒精依賴有關[11]。同樣的改變也出現在可卡因依賴者的腦部結構中，提示酒精和可卡因的表觀遺傳調節機制有共性，其他易成癮物質是否也具有相同的調節機制尚待研究[31]。

HMT 和KDM 協同調控組蛋白甲基化過程，研究證明了HMT 在可卡因和嗎啡成癮的神經適應中起因果作用，組蛋白甲基轉移酶PRDM2 參與了背外側前額葉皮質（dmPFC）的轉錄，導致了酒精成癮的發展。而有研究發現組蛋白去甲基化酶KDM6B（也稱為JMJD3）在酒精依賴的嚙齒動物和人類大腦中存在特定區域的持續失調。KDM6B 在小膠質細胞（大腦中的常駐免疫細胞）中富集，調節免疫應答基因對炎癥刺激的誘導，酒精會增加促炎細胞因子的轉錄，炎癥細胞因子的持續升高已被證明會增加對酒精的渴望和依賴程度，炎癥越來越被認為是酒精成癮發展的基礎。體內KDM6B 蛋白在急性酒精暴露、耐受和依賴、急性戒斷和延長使用的過程中受到動態調節，KDM6B 可去除H3 上的三甲基標記，調節炎癥基因的轉錄。抑制炎癥的化合物在治療酒精成癮的臨床試驗中已取得了成功，KDM6B 靶向化合物可同時糾正表觀遺傳和神經炎癥信號過程，有望在AUDs 治療中發揮關鍵效用[14]。

組蛋白甲基化可開啟或沉默心臟相關核心轉錄因子的轉錄，因此同樣在心臟發育中起到了舉足輕重的作用。前文提到H3K9 乙酰化與心臟發育有關，H3K9 三甲基化同樣重要，而且還與心肌肥厚及心力衰竭等病理生理過程息息相關。羅孝美等研究結果表明，母親孕期飲酒可使H3K9me3 水平顯著降低，引起GATA4 的過表達，與此同時Cx43、β-MHC 等心臟發育下游因子也會受到影響[24]。提示酒精暴露所致的心臟發育異常不僅與乙酰化有關，甲基化修飾也起到了至關重要的作用。

3.3 組蛋白磷酸化

組蛋白磷酸化由蛋白激酶介導，多發生在蘇氨酸和絲氨酸殘基上，與轉錄激活、DNA 修復有關，有時還參與到細胞周期動力學中。H3 磷酸化可調節某些重要的神經通路，如在H3 的絲氨酸10 位上（H3S10）阻斷磷酸化可減弱對可卡因和嗎啡的行為反應。精神興奮劑如苯丙胺、可卡因以及嗎啡均可增加組蛋白H3S10 的磷酸化水平[32]。產前酒精暴露則會導致組蛋白激活標記H3S10 減少[5]。說明組蛋白磷酸化也在一定程度上參與了酒精等物質成癮過程。

綜上所述，酒精流行面廣，又與社會文化緊密相連，傳統觀念里的低害化促成了酒精濫用。長期接觸酒精可能通過組蛋白的乙酰化、甲基化和磷酸化等共價修飾途徑改變蛋白表達，逐步發展成精神依賴，影響突觸可塑性，最終形成長期的神經功能改變[22]。了解酒精在表觀遺傳方面的作用不僅有助于深入認識酒精成癮的發生機制，也可為探索新的治療方式及藥物開發提供一定的指導意義。