口腔鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)環(huán)狀RNA的表達(dá)及作用

房旭，阮強(qiáng)，劉維賢

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 1.口腔頜面外科；2.病毒研究室，沈陽 110004）

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是常見的口腔頜面部惡性腫瘤，發(fā)病率逐年上升［1］。OSCC在確診時(shí)常為中晚期或已經(jīng)發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差，5年生存率僅為50%［2］，因此，研究OSCC的發(fā)病機(jī)制和腫瘤標(biāo)志物以及新型治療干預(yù)手段十分必要。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是非編碼RNA家族的重要成員，約40年前首次發(fā)現(xiàn)于類病毒和RNA病毒［3-4］，隨后HSU等［5］在真核細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了circRNA。近年來，生物信息學(xué)和新一代RNA測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展使circRNA成為非編碼RNA家族新的研究熱點(diǎn)［6］。研究發(fā)現(xiàn)，circRNA在OSCC組織中存在差異表達(dá)現(xiàn)象，提示circRNA在OSCC的發(fā)生、發(fā)展和侵襲等方面存在潛在的研究?jī)r(jià)值，并有望成為OSCC診斷和治療的潛在靶標(biāo)。

1 circRNA概況

1.1 circRNA產(chǎn)生機(jī)制

circRNA由前體信使mRNA衍生而來，主要包括外顯子circRNA、內(nèi)含子circRNA和外顯子-內(nèi)含子circRNA3種。circRNA的成環(huán)機(jī)制如下：（1）RNA結(jié)合蛋白（RNA binding proteins，RBPs）調(diào)控的環(huán)化，即當(dāng)外顯子上的側(cè)翼內(nèi)含子與RBPs結(jié)合時(shí)，可以促進(jìn)circRNA的形成［7］；（2）內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)的環(huán)化，形成circRNA的前體序列中，外顯子側(cè)翼內(nèi)含子中含有長(zhǎng)反向互補(bǔ)序列，兩側(cè)內(nèi)含子通過競(jìng)爭(zhēng)配對(duì)介導(dǎo)circRNA的形成［8］；（3）套索驅(qū)動(dòng)的環(huán)化，在pre-RNA轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)生部分折疊，外顯子隨后出現(xiàn)跳躍現(xiàn)象，使被跨越的區(qū)域形成circRNA中間體，然后通過剪切形成circRNA［9］。除了上述circRNA，還有一種特殊類型的circRNA，即融合circRNA，研究［10］發(fā)現(xiàn)circRNA像蛋白基因一樣也受到基因重排的影響而發(fā)生異常融合，這些異常融合的circRNA也會(huì)參與促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

1.2 circRNA特點(diǎn)及功能

1.2.1 特點(diǎn)：（1）豐富性，circRNA廣泛存在于植物、動(dòng)物等多種生物中［11］；（2）穩(wěn)定性，circRNA缺乏5’端和3’端結(jié)構(gòu)，對(duì)RNA核酸外切酶的降解并不敏感，因此其半衰期是線性RNA的10倍［7］；（3）特異性，circRNA表達(dá)具有物種特異性［12］、組織特異性［13］、發(fā)育階段特異性［14］及細(xì)胞特異性［15］；（4）保守性，circRNA具有高度保守的位點(diǎn)［16］，使疾病相關(guān)的circRNA干擾研究更加穩(wěn)定。

1.2.2 功能：（1）miRNA海綿作用，circRNA中富含miRNA結(jié)合位點(diǎn)，具有miRNA海綿作用［17］；（2）調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，EIciRNAs已被證明具有順式調(diào)節(jié)功能［18］，circRNA還可與RNA聚合酶Ⅱ復(fù)合物作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄［19］；（3）編碼蛋白作用，研究［20］證明circRNA可模擬DNA的滾環(huán)擴(kuò)增法，故可用于真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)。

1.3 circRNA與腫瘤相關(guān)性

在惡性腫瘤中，circRNA差異表達(dá)可能影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transformation，EMT）、血管生成及細(xì)胞凋亡等多種生理過程。目前對(duì)于circRNA與惡性腫瘤相關(guān)性的研究主要有兩大類，一類是通過高通量測(cè)序確定circRNA在癌癥中的表達(dá)差異，從而尋找潛在的癌癥診斷生物標(biāo)志物，另一類是研究circRNA在癌癥發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。

2 circRNA在OSCC中的作用機(jī)制

2.1 circRNA在OSCC中發(fā)揮miRNA海綿作用

目前，circRNA在腫瘤中的作用機(jī)制的研究大部分集中于競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）假說，ceRNA中含有miRNA的應(yīng)答元件（microRNA response element，MRE），通過MRE競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA調(diào)節(jié)基因表達(dá)和功能。circRNA可以通過“circRNAs-miRNAs-mRNAs”軸調(diào)控OSCC的發(fā)生發(fā)展。目前已經(jīng)證實(shí)11種circRNA可在OSCC中充當(dāng)miRNA的調(diào)節(jié)劑，其中5種circRNA在致癌過程中表達(dá)下調(diào)，充當(dāng)腫瘤抑制因子，6種circRNA上調(diào)并充當(dāng)致癌基因［22-33］。hsa_circRNA_100290可充當(dāng)致癌基因，作為ceRNA調(diào)節(jié)miR-378a及其靶基因GLUT1的表達(dá)。GLUT1在OSCC中表達(dá)上調(diào)并參與OSCC的細(xì)胞糖酵解，從而調(diào)控細(xì)胞的遷移和侵襲，因此，hsa_circRNA_100290可能通過miR-378a上調(diào)GLUT1基因的表達(dá)，從而促進(jìn)OSCC的糖酵解和細(xì)胞增殖［21］。hsa_circ_0002185也被稱為circUHRF1，通過充當(dāng)miR-526b-5p的海綿，正向調(diào)節(jié)c-Myc基因。circUHRF1在OSCC中表達(dá)下調(diào)，并抑制腫瘤的增殖、遷徙、侵襲和EMT，證實(shí)了circUHRF1在OSCC中的致癌作用。此外，c-Myc基因已被證實(shí)是OSCC中重要的致癌基因和轉(zhuǎn)錄因子，可促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）和上皮剪接調(diào)節(jié)蛋 白1（epithelial splicing regulatory protein 1，ESRP1）mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。ESRP1是參與EMT進(jìn)程的一種剪接因子，已被確定為靶向的側(cè)翼內(nèi)含子，可促進(jìn)circUHRF1的環(huán)化，因此，circUHRF1在EMT進(jìn)程中構(gòu)建了circUHRF1/miR-526b-5p/c-Myc/TGF-β1/ESRP1反饋環(huán)［22］，提示可以通過在側(cè)翼內(nèi)含子區(qū)域搜索互補(bǔ)序列來探索和預(yù)測(cè)潛在的新型circRNA。circ-PKD2在OSCC組織及細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，充當(dāng)抑癌因子，既促進(jìn)OSCC細(xì)胞凋亡，又抑制OSCC細(xì)胞的增殖和侵襲。circ-PKD2通過抑制miR-204-3p的表達(dá)，調(diào)節(jié)miR-204-3p的潛在靶點(diǎn)——腺瘤性結(jié)腸息肉相關(guān)基因2（adenomatous polyposis coli 2，APC2）的表達(dá)水平。APC2下調(diào)可顯著逆轉(zhuǎn)circ-PKD2過表達(dá)對(duì)OSCC惡性進(jìn)展的促進(jìn)。以上結(jié)果表明circ-PKD2/miR-204-3p/APC2軸是參與OSCC發(fā)病機(jī)制的一條新途徑，為OSCC的治療靶點(diǎn)提供了新選擇［23］。

2.2 circRNA在OSCC中與蛋白質(zhì)結(jié)合起調(diào)節(jié)作用

circ-MMP9（hsa-circ-0001162）來源于基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP），可調(diào)節(jié)OSCC患者組織中MMP-9的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9在多種OSCC中均呈高表達(dá)［24］，并與OSCC的轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)［25］。XIA等［26］發(fā)現(xiàn)，circRNA_MMP9在OSCC中表達(dá)上調(diào)，可促進(jìn)OSCC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，并抑制細(xì)胞凋亡，同時(shí)還證實(shí)了circ-MMP9可與AU富集元件結(jié)合因子1（AU-rich element binding factor1，AUF1）和miR-149相互作用，阻斷AUF1和miR-149對(duì)MMP-9的抑制作用。AUF1是一種mRNA失穩(wěn)劑［27］，circ-MMP9與AUF1的物理結(jié)合可增加MMP-9mRNA的穩(wěn)定性，從而促進(jìn)OSCC的轉(zhuǎn)移。

2.3 circRNA在OSCC中可直接或間接調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

正常情況下，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以精準(zhǔn)傳導(dǎo)細(xì)胞外引起的各類信號(hào)刺激。傳導(dǎo)系統(tǒng)中某一環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題可導(dǎo)致基因表達(dá)發(fā)生異常改變，進(jìn)而影響細(xì)胞的正常生物學(xué)功能，最終導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)移。circRNA_102459的上調(diào)或circRNA_043621的下調(diào)可通過抑制MAPK和PI3K/Akt通路抑制OSCC的發(fā)生發(fā)展［28］。circ_0000140通過海綿化miR-31，釋放大腫瘤抑制因子2，調(diào)節(jié)OSCC中的Hippo信號(hào)通路［32］。hsa_circ_0008309通過海綿化miR-136-5P和miR-382-5P調(diào)節(jié)ATXN1基因的水平，進(jìn)一步調(diào)節(jié)Notch信號(hào)通路，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲［29-30］。由此可見，circRNA可以通過直接或間接調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的方式調(diào)控OSCC發(fā)生發(fā)展。

3 circRNA與OSCC診斷

1項(xiàng)meta分析匯總了19項(xiàng)具有腫瘤組織的circRNA以及配對(duì)的相鄰非腫瘤組織的circRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，其綜合曲線下面積（area under curve，AUC）達(dá)0.79，綜合靈敏度為0.72，綜合特異度為0.74，提示circRNA具有癌癥診斷生物標(biāo)志物的價(jià)值［31］。WANG等［32］通過高通量測(cè)序?qū)SCC患者的癌組織及癌旁組織進(jìn)行檢測(cè)，獲得了微陣列circRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)circRNA分子在OSCC患者中有差異表達(dá)現(xiàn)象。多個(gè)課題組對(duì)OSCC患者的癌組織及癌旁組織的表達(dá)譜進(jìn)行了對(duì)比分析，篩選出了一批差異顯著的circRNA，如hsa_circRNA_102459［37］，hsa_circRNA_043621［37］，hsa_circ_0072387［33］，hsa_circ_001242［34］及hsa_circ_009755［35］等。LI等［36］采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了55例OSCC樣本中hsa_circ_0086414的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0086414在OSCC組織中的表達(dá)顯著下調(diào)，并通過建立受試者工作特征曲線發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0086414可能是OSCC中必不可少的診斷生物標(biāo)志物。除鑒別異常組織外，OSCC患者的唾液、外泌體和臨床標(biāo)準(zhǔn)血液樣本中均可檢測(cè)出circRNA的差異，ZHAO等［37］研究證明，唾液hsa_circ_0001874與TNM分期（P=0.006）和腫瘤分級(jí)（P=0.023）有關(guān)，hsa_circ_0001971與TNM分期有關(guān)（P=0.019），表明唾液hsa_circ_0001874和hsa_circ_0001971作為診斷OSCC生物標(biāo)志物的潛力。如果臨床上能夠通過患者的唾液或血液，在早期無創(chuàng)、快速和準(zhǔn)確地診斷OSCC，無疑將極有助于改善患者的預(yù)后及5年生存率，因此，circRNA在診斷或預(yù)測(cè)疾病方面可能具有重要意義。

4 circRNA與OSCC的發(fā)生和發(fā)展

研究證實(shí)，致癌circRNA，如circDOCK1［29］、circ-HIPK3［26］、hsa_circ_0011946［38］，在OSCC組織中表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)OSCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并抑制細(xì)胞凋亡，反之則會(huì)降低OSCC細(xì)胞的活力，抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。相反，抑 癌circRNA，如circRNA_0000140［32］、hsa_circ_0002203［39］、hsa_circ_0063772［40］、hsa_circ_0004 491［41］、hsa_circ_0007059［42］、hsa_circ_0092125［43］、hsa_circ_0055538［44］，在OSCC細(xì)胞中呈低表達(dá)，若過表達(dá)這些抑癌circRNA，可抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞增殖調(diào)控是一個(gè)精準(zhǔn)又復(fù)雜的過程，受包括凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax及MMP9在內(nèi)的多種信號(hào)因子的影響。其中，Bcl-2是一種抑制細(xì)胞凋亡的癌基因，Bax與Bcl-2有相互拮抗的作用，是細(xì)胞凋亡的促進(jìn)基因，MMP-9是與腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲相關(guān)的蛋白酶。這些信號(hào)因子通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期發(fā)揮作用。研究［43］發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)hsa_circ_0007059時(shí)，Bax上調(diào)而Bcl-2、MMP-9下調(diào)，抑制了OSCC細(xì)胞的惡性行為。研究［41］發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)hsa_circ_0063772后，腫瘤細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)水平明顯降低，腫瘤細(xì)胞的增殖能力受到抑制，MMP-9蛋白的表達(dá)水平也降低，腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲能力減弱。SU等［45］研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0055538通過p53信號(hào)通路調(diào)節(jié)Bax與Bcl-2的表達(dá)，并可能參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)。另外，EMT過程在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中也發(fā)揮著重要作用，使上皮細(xì)胞間失去細(xì)胞極性，腫瘤細(xì)胞間失去連接，致使腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力顯著增強(qiáng)。研究［42］顯示，circRNA與EMT過程密切相關(guān)，hsa_circ_0004491沉默或過表達(dá)后，EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)發(fā)生了顯著變化，說明hsa_circ_0004491調(diào)節(jié)OSCC細(xì)胞中的EMT進(jìn)展，并可能調(diào)控OSCC的發(fā)生發(fā)展過程。PENG等［31］發(fā)現(xiàn)，在circ_0000140過表達(dá)的OSCC組織中，EMT的相關(guān)蛋白E鈣黏附蛋白增加，而N鈣黏附蛋白減少，說明circ_0000140干擾了OSCC中的EMT表達(dá)。因此，circRNA可能通過參與細(xì)胞增殖和EMT過程調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。

5 circRNA與OSCC的治療

circRNA可調(diào)節(jié)參與腫瘤發(fā)展基因的表達(dá)，若干擾circRNA在OSCC細(xì)胞中的表達(dá)，可有效抑制和逆轉(zhuǎn)各種惡性生物學(xué)行為。文獻(xiàn)［45］報(bào)道，hsa_circ_0005379通過調(diào)節(jié)抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）途徑參與腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。EGFR的高表達(dá)與腫瘤的早期轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后存在密切關(guān)系。目前已開發(fā)出一系列針對(duì)EGFR的靶向療法，其中，西妥昔單抗對(duì)EGFR具有高親和力，可通過與EGFR特異性結(jié)合抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，具有良好的療效，但卻存在耐受性。hsa_circ_0005379的高表達(dá)可增加西妥昔單抗對(duì)EGRF的敏感性，為將來的OSCC抗癌藥物設(shè)計(jì)提供了新的潛在目標(biāo)。以上均為針對(duì)circRNA下游基因的治療思路，由于circRNA的調(diào)控位于腫瘤發(fā)展的中央環(huán)節(jié)，也可通過調(diào)控其上游基因調(diào)節(jié)circRNA的作用。ZHANG等［46］研究發(fā)現(xiàn)，巖藻依聚糖可作為上游因子調(diào)控circFLNA的表達(dá)，二者均可介導(dǎo)與細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、遷移和侵襲有關(guān)的關(guān)鍵蛋白的表達(dá)。巖藻依聚糖還可通過提高Bax/Bcl-2的比率誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并通過抑制MMP-9和MMP-2的表達(dá)來抑制OSCC細(xì)胞的遷移和侵襲。因此，認(rèn)為巖藻依聚糖可能是治療OSCC的潛在天然藥物。

6 總結(jié)

circRNA作為RNA 領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，其產(chǎn)生、結(jié)構(gòu)、特點(diǎn)和生物學(xué)功能正在被逐步探索，為OSCC患者尋找合適的腫瘤篩查指標(biāo)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤早發(fā)現(xiàn)、早治療，提高患者的治愈率和生存率。circRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的調(diào)控作用，能夠參與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等多種病理過程。由于circRNA在血液、唾液中廣泛分布，因此，在OSCC早期診斷中作為生物標(biāo)志物具有一定的潛能。如何運(yùn)用circRNA的生物學(xué)功能治療和診斷OSCC仍需要深入研究。

綜上所述，circRNA在OSCC的診斷、治療及預(yù)后中具有巨大的研究空間和應(yīng)用潛力，期待未來能成為重要的生物標(biāo)志物應(yīng)用于臨床中。