伴骨髓增生異常相關改變的急性髓系白血病細胞遺傳學及分子生物學研究進展

吳安 歐陽桂芳 牧啟田

伴骨髓增生異常相關改變的急性髓系白血病（acute myeloid leukemia with myelodysplasia-related changes,AML-MRC）是2008年WHO正式命名的一個急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）亞型，這類患者通常具有發病年齡大、合并嚴重貧血癥狀、CD14高表達、預后差等特征。隨著DNA芯片、二代測序等技術在臨床上的廣泛應用，AML-MRC遺傳學本質也被不斷發現。本文就AML-MRC遺傳學和分子生物學研究進展作一綜述。

1 AML-MRC概念

2001年WHO將細胞遺傳學與細胞形態學、細胞化學、免疫表型和臨床信息結合到髓樣腫瘤的診斷中，并引入“伴多譜系發育不良的AML”這一新的亞型，以骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome,MDS）樣表現為特征的AML病例歸為此類型。2008年WHO正式將該病命名為AML-MRC，并定義為外周血或骨髓中具有至少20%的原始細胞并具備以下任何一種情況：（1）髓系中至少兩系50%及以上的細胞存在病態造血；（2）伴有骨髓增生異常的形態學特征或有MDS或骨髓增殖性腫瘤（myeloproliferative neoplasms,MPN）病史；（3）存在MDS相關的細胞遺傳學異常。2016年WHO將伴del（9q）、NPM1突變或雙等位基因CEBPA突變的多系病態造血的AML排除在AML-MRC之外，由于伴有這些遺傳學改變的AML具有不同的臨床轉歸[1]。

2 AML-MRC的細胞遺傳學特征

AML-MRC的細胞遺傳學特征具有很大的異質性，主要包括平衡易位和非平衡易位，其中以非平衡易位為主。按照2008年WHO髓系腫瘤分類標準，AMLMRC染色體異常與MDS特異性染色體核型基本相符，反映其MDS特性。非平衡易位主要表現-7/7q-、-5/5q-、i(17q)/t(17p)、-13/13q-、11q-、12p-/t(12p)、9q-、idic(X)(q13)；而平衡易位主要表現 t(11;16)(q23;p13.3)、t(3;21)(q26.2;q22.1)、t(1;3)(p36.3;q21.1)、t(2;11)(p21;q23)、t(5;12)(q33;p12)、t(5;7)(q33;q11.2)、t(5;17)(q33;p13)、t(5;10)(q33;q21)、t(3;5)(q25;q34)[1]。此外，AML 伴有復雜核型（complex karyotype,CK；3個及以上無關染色體異常）也歸為AML-MRC亞型。但需要排除伴重現性細胞學異常的 AML（acute myeloid leukemia with recurrent genetic abnormalities,AML-RGA），如 t(8;21)、t(15;17)、t(9;11)、inv(16)/t(16;16)等 AML 類型[2]。

2.1 -7/7q-、-5/5q-染色體異常 -5/5q-、-7/7q-是MDS最常見的染色體異常，其中-5/5q-占30%，-7/7q-占21%[3]。在AML中，單純-5/5q-并不常見，約占10%；且大多合并其他染色體異常[如-7/17p異常、CK、單體核型（monosomal karyotype,MK）或 TP53基因突變]，因此總體生存率較差，即使異基因造血干細胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,HSCT）也不能改善患者預后[4]。此外，在AML病例中，存在-7/7q-者往往預后不良[5]。

2.2 t(v;5q33)/t(3;5)染色體異常 2008年WHO將具有PDGFRA、PDGFRB或FGFR1突變并伴嗜酸性粒細胞增多的髓系腫瘤或淋巴系統腫瘤作為血液系統腫瘤的一個新的亞型。在AML-MRC中，t(v;5q33)主要涉及的5q33區域也發生PDGFRβ基因重排。目前，研究發現與5q33重排相關的髓系腫瘤染色體異常主要有t(5;12)、t(5;7)、t(5;17)和 t(5;10)，臨床上均為罕見病例。Yabe等[6]在2 000多例血液腫瘤病例中篩選到9例t(v;5q33)染色體異常的AML，其中4例由MPN轉化而來，同時發現5例新發AML與4例轉化的AML患者在整個病程中均未出現嗜酸性粒細胞增高的現象；進一步研究發現，9例患者中有4例表現為單純t(v;5q33)染色體異常，其余為CK，且絕大部分患者伴有FLT3、ABL1和RAS基因突變；而在骨髓細胞形態上，只有1例患者表現為至少兩系50%以上的細胞存在病態造血。除了PDGFRβ基因重排外，Vardiman等[7]報道了1例t(5;11)染色體異常的AML-MRC患者，此易位形成的是NUP98-NSD1融合基因，該患者常規染色體核型為5q-，而熒光原位雜交證實為t(5;11)，即隱匿性染色體易位。

t(3;5)涉及染色體3q25.1和5q34位點，易形成NPM1-MLF1融合基因[8]。t(3;5)染色體異常多為單純易位（約占72.5%），少數伴有附加染色體異常，最常見附加染色體為+8。這類型的AML-MRC患者多為FAB分型中的M2、M4和M6亞型，CD117、CD13和CD33表達陽性而CD34表達陰性；WT1基因突變多見，表達圖譜與NPM1突變類似。臨床上報道t(3;5)染色體異常的AML病例預后并不一致[9-11]。

2.3 t(v;11q23)染色體異常 在AML平衡易位中，除了5q33位點外，11q23位點也是較為多見的易位位點，涉及的該位點多形成MLL（KMT2A）基因重排。按照2008年WHO相關分類和定義，與AML-MRC相關的11q23易位只有 t(2;11)(p21;q23)、t(11;16)(q23;p13.3)。Fleischman等[12]總結了19例存在t(2;11)異常的患者，發現14例為MDS，而且很快進展為AML。目前為止，尚未鑒定出t(2;11)易位基因MLL的對手基因。據報道，t(11;16)易形成MLL/CBP融合基因，t(11;16)髓系腫瘤（包括治療相關的MDS或AML）特殊之處在于，幾乎所有病例接受過鬼臼素等拓撲異構酶Ⅱ抑制劑藥物治療，因此也可歸為治療相關髓系腫瘤亞型。研究表明，MLL/CBP融合基因多累及粒系和單核系成熟細胞，也會累及紅系原始細胞，甚至部分患者可從AML轉化成急性淋巴細胞白血病[13]。

2.4 MK/CK與AML-MRC的關系 MK定義為有2個常染色體單體或1個常染色體單體和1個結構異常并存，但需要排除 t(15;17)、t(8;21)、inv/t(16)等 AMLRGA[1]。2016年WHO髓系腫瘤分類中并未將MK定義為AML-MRC的特殊染色體異常，但近年來研究證實兩者存在密切關系。Weinberg等[14]研究發現，在新發的AML患者中，約10%存在MK；而且這類患者發病年齡較大，骨髓原始細胞比例較低，CD34呈低表達，通常為伴有多系病態造血的AML-MRC。MK最常見染色體異常為-5/5q（占55%），其次為-7（占45%）。盡管MK-AML是臨床治療的棘手難題，但近年來研究結果也帶來一些希望。Wierzbowska等[15]對年齡＞65歲的AML患者進行研究發現，與傳統化療比較，去甲基化藥物地西他濱作為一線治療藥物能明顯提高MK-AML患者的緩解率（27%比3%）和中位生存期（6.3個月比2.6個月），差異均有統計學意義（均P＜0.05）。但對于高風險老年AML患者，去甲基化藥物與傳統化療相比優勢不大。

CK定義為一個細胞內有3個及以上無關染色體異常。在AML患者中，約10%～14%存在CK，且與TP53突變密切相關[2]。Devillier等[16]納入了125例AML-MRC患者（包括CK-AML患者42例），研究結果顯示AMLMRC患者易出現CK。但這類患者通常預后極差，HSCT是其長期生存獲益的治療方法之一，但仍具有較高的復發率[2]。研究發現，一種新型賴氨酸特異性脫甲基酶1抑制劑NCD38可以通過抑制造血調節因子的超級增強子來延緩白血病的發展進程，體內實驗結果顯示NCD38對伴CK的AML-MRC患者具有較好的療效[17]，這為將來新藥的開發提供了思路。

3 AML-MRC的分子生物學特征

3.1 基因突變類型 劉銘等[18]通過DNA測序分析了97例初診MDS和AML-MRC患者，發現常見的15種基因突變包括：（1）RNA剪接因子基因U2AF1、SF3B1、SRSF2；（2）表觀遺傳調節基因 ASXL1、DNMT3A、IDH1、IDH2 和 TET2；（3）信號轉導通路基因 JAK2、NRAS、KRAS和 PTPN11；（4）TP53、RUNX1 和 SETBP1。

AML-MRC不僅保留了MDS的細胞遺傳學特征，也保留了其分子生物學特征。研究表明，MDS早期很少出現嚴格意義上與新發AML相關的基因改變，如NPM1、CEBPA突變和MLL重排。當MDS進展時，可出現 RUNX1、GATA2、CEBPA、FLT3 及 RAS 家族基因突變[19]。因此，AML-MRC患者基因突變數目明顯多于MDS。此外，Yokoyama等[20]利用流式細胞分選技術檢測發現，新發AML患者的基因突變（除DNMT3A、TET2和ASXL1外）主要集中在原始細胞群，而MDS和AML-MRC患者的基因突變可以出現在原始細胞群、成熟粒細胞群和T細胞群，提示MDS和AML-MRC起源于更早的多能干細胞或多能祖細胞，可幫助鑒別新發AML和AML-MRC。盡管AML-MRC涉及的突變基因較多，但AML-MRC僅與ASXL1和U2AF1突變明顯相關，且該類型較易出現 TP53 突變[16，21]。

3.2 基因突變特點

3.2.1 ASXL1基因突變特點 ASXL1基因位于20q11染色體，編碼一個長為1 541個氨基酸的核蛋白。ASXL1基因突變發生于多種髓系腫瘤，包括慢性粒單核細胞白血病（chronic myelomonocytic leukemia,CMML）、MDS、MPN和AML 等，通常與 EZH2、IDH1/2、RUNX1及TET等基因突變協同出現，多為移碼突變和無義突變[22]。Devillier等[23]比較了細胞遺傳學中危風險的36例AMLMRC患者和37例新發AML患者的ASXL1基因突變情況，結果發現AML-MRC組ASXL1基因突變的發生率遠高于新發AML組（47%比0%，P＜0.01）；同時還發現ASXL1基因突變與RUNX1基因突變呈正相關，與DNMT3A、NPM1和FLT3基因突變呈負相關。該研究團隊在另一篇報道中分析125例AML-MRC患者的ASXL1基因突變情況，結果發現伴有ASXL1基因突變的患者比野生型患者的粒系細胞發育異常率更高，并證明ASXL1基因突變是其預后不良的獨立影響因素[16]。有研究在斑馬魚動物模型中用基因組編輯技術使單倍體的ASXL1基因發生突變，結果發現能誘導新生造血干細胞發生凋亡，如果同時敲除TET基因，能誘導AML的發生[24]。由此可見，ASXL1不僅參與髓系腫瘤的發生，也促進髓系腫瘤的進展。

ASXL1蛋白可與polycomb抑制復合物2（polycomb repressive complex2,PRC2）的核心蛋白EZH2結合，其突變常導致骨髓造血功能異常，加速腫瘤（如MDS、MPN、CMML、AML）的發生[25]。基于 ASXL1 基因在髓系腫瘤中的廣泛突變以及在AML-MRC發生進程中起促進作用，開發針對ASXL1基因突變的藥物具有重要意義。PRC2以EZH1/2作為催化亞基，研究表明口服選擇性抑制劑UNC1999可同時抑制EZH2和EZH1賴氨酸甲基轉移酶，在AML小鼠模型中顯示出良好的治療效果。此外，GSK126、GSK343、EPZ005687、EPZ-6438 等小分子抑制劑在小鼠模型中均顯示出較好的EZH1/2活性抑制作用，因此研發針對EZH1/2基因突變的抑制劑有望成為新的AML-MRC靶向治療藥物[25]。

3.2.2 TP53基因突變特點 TP53是位于17p13.1的抑癌基因，TP53缺失或異常與17p異常有關[25]。在MDS中，TP53基因突變與5q-、高度CK和MK密切相關，是MDS預后風險最差指標之一[26]。在AML中，TP53基因突變發生率約為5%～10%，與化療耐藥和復發密切相關[27]。研究表明，將AML細胞株TP53基因敲除并不能促使染色體數目發生異常，但能誘發染色體結構異常[28]，這一結果與臨床上觀察到的TP53基因突變患者常常伴有CK的現象相符[21]。盡管未見文獻報道TP53基因突變與AML-MRC存在密切關系，但在AML-MRC中TP53基因突變比例高達22%，明顯高于新發AML[16]。AML-MRC患者整體預后不良，但如果伴有TP53基因突變，則預后更差。研究表明，MDM2負性調控TP53基因，因此MDM2抑制劑可促進TP53表達，進而誘導腫瘤細胞凋亡。目前，MDM2抑制劑單獨或與其他化療藥物、BCL-2抑制劑或MEK抑制劑聯合治療難治性AML患者并取得良好的療效。但MDM2抑制劑需要野生型TP53蛋白才能發揮其生物學功能，因此對TP53基因突變患者的療效往往不佳。令人欣慰的是，目前已經研發出一種小分子化合物APR-246，它能重塑突變TP53的蛋白，恢復其正常生理功能[29]。一項Ⅰb/Ⅱ期臨床試驗研究采用APR-246和去甲基化藥物序貫治療伴有TP53的突變的MDS和AML患者，初步結果顯示5例患者中有4例骨髓獲得完全緩解，提示這類小分子化合物或許能為伴有TP53基因突變的AML-MRC患者帶來希望。

3.2.3 U2AF1基因突變特點 U2AF1是一種U2輔助因子蛋白，可識別內含子3'端的AG剪接受體二核苷酸。U2AF1基因突變使許多基因包括剪切體和RNA識別基序（RRM）基因表達下調，導致RNA剪接的異常，影響靶蛋白翻譯。U2AF1基因突變發生在5%～12%的MDS 中，最常見于 20q-和+8 核型[25，30]。

U2AF1基因突變與AML-MRC存在密切關系。吳凌云等[30]對349例MDS患者進行二代測序，結果發現30例存在U2AF1基因突變，其中U2AF1基因突變組白血病轉化率明顯高于未突變組，差異有統計學意義（40%比23%，P＜0.05）。Ohgami等[21]分析 93例 AML 患者[包括 AML-MRC 36 例、AML-未另行規定（not otherwise specified,NOS）31例、AML-RGA 17例、治療相關的AML 9例]，結果發現AML-MRC患者基因突變頻率最高，以NRAS、RUNX1、U2AF1和TP53基因突變較為常見；同時發現U2AF1基因突變與三系發育異常密切相關。Cho等[31]研究發現，U2AF1基因突變的AML-MRC患者WBC更低，發病年齡更小，+8染色體異常率更高。U2AF1基因突變患者往往預后較差。有文獻報道伴有U2AF1及TP53基因突變的AML患者緩解率極低，總生存期和無病生存期均較差，是AML患者預后不良的獨立影響因素[21]。因此，U2AF1基因突變情況能在一定程度上預測AML患者的臨床預后。

3.3 共突變特點 在髓系腫瘤中，RNA剪切體基因突變常表現為相互排斥，但易與表觀遺傳學基因突變同時存在[18]。有文獻報道MDS向AML轉化過程中同時出現2個及以上的基因突變，而共突變基因的出現在MDS轉化過程中起重要作用[32]。有研究對97例原發MDS和MDS轉化而來的AML患者進行分析，結果顯示23.71%攜帶2種及以上基因突變，不同突變的組合中以U2AF1和ASXL1共突變頻率最高（占39.1%），其中MDS轉化而來的AML 2例，MDS 7例；在7例MDS中，有5例最終發展為AML，提示U2AF1和ASXL1共突變的患者預后較差[18]。研究證實，TET2和SRSF2共突變可預測MDS向AML轉化[33]。基于疾病的基因突變積累，AML-MRC患者具有3個及以上基因共突變的比例明顯高于AML-NOS和伴復發性遺傳學異常的AML[21]。共突變基因類型也存在選擇性，Devillier等[16]研究發現，在AML-MRC中，ASXL1基因突變頻率最高，主要見于非 CK（31%），可以與 RUNX1、DNMT3A、NPM1、FLT3-ITD等基因形成共突變；而TP53基因突變主要見于CK，很少與其他基因形成共突變。此外，研究證實共突變基因的數目越多，髓系腫瘤患者的預后越差[34]。由此可見，在髓系腫瘤中，共突變在一定程度上反映了疾病發生、發展的進程，同時也能預測疾病的預后。

4 小結

近年來，人們對AML-MRC的細胞遺傳學特征有了基本認識，包括-5/5q-、-7/7q-、t(v;5q33)、t(3;5)、t(v;11q23)、CK、MK等。一些研究闡釋了AML-MRC的分子生物學特征，如TP53、U2AF1及ASXL1基因突變可能提示預后較差。目前AML-MRC相關靶向治療藥物也進入臨床前期研究階段，為AML-MRC患者帶來希望。但這些遺傳學研究的發現只是AML-MRC發病機制研究的冰山一角，目前尚不了解染色體微缺失、微重復、微小RNA、表觀遺傳學、長鏈非編碼RNA等遺傳學改變與AML-MRC的關系，需要進一步深入研究來解決。