外泌體作為腦血管疾病治療藥物載體的研究進展

謝 姿， 馬曉瑭， 張惠婷綜述， 鐘望濤審校

腦血管疾病是我國乃至全球最嚴重的疾病負擔之一，具有高死亡率、高復發率和高致殘率[1]。由于血腦屏障(blood brain barrier,BBB)的阻礙，許多潛在治療藥物缺乏有效的遞送方式，它們的臨床應用受到限制。因此迫切需要開發新的治療方法來克服BBB，提高療效。眾所周知，外泌體是一種由不同類型的細胞釋放到細胞外基質的膜性小囊泡，廣泛存在于細胞培養上清以及各種體液中，直徑約為30 nm～150 nm，是細胞外囊泡的最小亞型[2]。它們在被釋放的過程中攜帶有細胞來源相關的多種蛋白質、脂類和核酸等生物大分子，是細胞間通訊的關鍵參與者[3]。自從發現外泌體在細胞間通訊的作用以來，以外泌體為載體的治療藥物研究不斷發展[4,5]。與目前可用的人工藥物遞送載體相比，外泌體具有多種優勢，首先，外泌體本身具有穿透BBB的能力，細胞靶向特性，其次，外泌體的循環穩定性可以避免巨噬細胞的吞噬作用，延長化學藥物的半衰期[6]。因此，外泌體在給藥過程中顯著提高了某些可生物降解藥物的給藥效率，為腦內藥物輸送提供了天然納米載體。本文概述了目前外泌體的載藥方式和腦靶向途徑，重點介紹了外泌體作為藥物載體介導的miRNAs、蛋白質和化學藥物遞送在腦血管疾病中的治療應用，并對目前外泌體載藥仍然存在的問題和挑戰進行了討論。

1 外泌體載藥方式

外泌體的脂質雙層膜可作為天然屏障保護負載的藥物，使其不會在血液中降解，極大地提高其治療效果。但是，這種膜以及外泌體內源性成分的存在卻阻礙了外源治療藥物的裝載。因此，要將外泌體應用于靶向治療，必須實現治療藥物的有效裝載。在此，將概述幾種不同的外泌體藥物裝載方法。

首先，最直接的方法是用需要負載的藥物直接孵育供體細胞，然后收集和純化用于疾病治療的治療性外泌體。這種方法主要用于小分子的負載。例如，MSCs和腫瘤細胞在與紫杉醇或甲氨蝶呤等化療物質孵育時，能夠將這些化療藥物包裝在它們分泌的外泌體中[7]。對于基因治療，病毒轉導(慢病毒、腺病毒)是用miRNA和siRNA轉染供體細胞的主要方法。通過使用這種預加載技術，MSC衍生的外泌體可將外源miRNA模擬物和pre-miRNA傳遞至人神經祖細胞(NPC)和星形膠質細胞[8]。盡管這種在外泌體生物發生過程中負載藥物的方法實現了外泌體在體外的藥物負載，但是由于外泌體內生物發生過程的復雜性，它的負載效率較低且不受控制。為了提高加載效率開發了一種新方法，即通過光學可逆的蛋白質-蛋白質相互作用(EXPLORs)進行蛋白質負載的外泌體。，Yim等人[9]通過將藍光控制的可逆蛋白質-蛋白質相互作用模塊與外泌體生物發生的內源性過程結合起來成功地將貨物蛋白裝載到新產生的外泌體中。

相比之下，將分離的外泌體與治療性分子一起孵育來進行被動裝載不僅更簡單，而且受控且加載效率相對較高。例如，將外泌體與疏水性姜黃素一起孵育可將姜黃素有效地裝載和遞送到大腦中[10]。然而，簡單的孵育僅能達到疏水劑可接受的負載效率。為了獲得親水性治療劑的更高的裝載效率，Alvarez-Erviti等人[11]通過電穿孔將siRNA加載到純化的外泌體中，而外泌體的物理特性沒有實質性改變。此外，皂苷透化、凍融循環、超聲處理和擠壓也已應用于外泌體藥物的裝載。Haney等人[12]比較了上述將抗氧化酶過氧化氫酶裝載到單核細胞/巨噬細胞衍生的外泌體中的方法的裝載效率，發現通過超聲處理，擠壓和皂苷透化可以達到更高的裝載效率。這些主動的加載過程保持了外泌體的完整性，還保護了加載的過氧化氫酶免受循環降解的影響。將藥物裝載到外泌體的各種方法各有不同的裝載能力，這取決于藥物的特性，如親水性、疏水性和分子量。除了考慮載藥效率，外泌體膜的完整性和穩定性在藥物傳遞中也很重要。如前所述，雖然通過超聲和擠壓將過氧化氫酶裝載到外泌體中可以獲得良好的酶活性，但也有研究發現膜完整性受損，膜結合蛋白結構可能發生改變，從而影響載藥外泌體的治療效果。因此，有必要進行進一步的研究。

2 外泌體腦靶向途徑

外泌體具有基于供體細胞的天然靶向能力，不同類型的天然外泌體可以粘附不同的細胞。外泌體的這種天然靶向能力取決于外泌體的組成以及受體細胞的生理狀態。外泌體表面配體與大腦內皮細胞受體之間的相互作用被認為是主要機制。例如，幼稚巨噬細胞外泌體可以通過外泌體上整合素淋巴細胞功能相關抗原1(LFA-1)與細胞間粘附分子1(ICAM-1)和腦微血管內皮細胞上的碳水化合物結合性C型凝集素受體之間的相互作用穿過BBB[13]。除了穿越BBB的進入途徑外，Grapp等人[14]還證明，外泌體也可以通過穿越脈絡叢中的腦脊液-腦屏障進入大腦。他們發現，脈絡叢上皮細胞產生的含葉酸受體-α(FRα)的外泌體可以穿過室管膜細胞層并分布到腦實質中，從而被星形膠質細胞和神經元攝取。這項研究提供了一種細胞特異性腦部藥物遞送途徑。

此外，還可用腦靶向肽編碼基因和外泌體蛋白質標記編碼基因的融合基因轉染祖細胞生成富含融合蛋白并具有穿越BBB能力的外泌體。例如，Alvarez等人[11]使用自衍生的樹突狀細胞來生產外泌體。通過對樹突狀細胞進行修飾以表達Lamp2b(一種外泌體膜蛋白)，該蛋白與狂犬病毒糖蛋白(RVG)肽融合，可以通過乙酰膽堿能受體靶向神經元來實現大腦靶向。鼻腔給藥也是外泌體穿過BBB并到達中樞神經系統內的一種方式，鼻腔給藥的藥物主要通過嗅覺和三叉神經通路被轉運到大腦[10]。盡管許多研究已經充分證明了鼻腔給藥后外泌體腦傳遞的可能性[15]，但具體機制尚待闡明。

3 外泌體載藥在腦血管疾病治療中的應用

3.1 缺血性腦卒中 缺血性腦卒中(ischemic stroke,IS)是一種常見的腦血管疾病，是老年人群嚴重殘疾和死亡的主要原因，占所有卒中的80%以上[16]。miRNAs是內源性的非編碼小RNA分子，不僅可以作為卒中的診斷和預后的生物標志物，同時也具有顯著的卒中治療潛力。miRNAs在細胞間的轉移被認為是外泌體發揮作用的關鍵物質[17]。例如，Hongqi Xin等人[18]發現MSC-外泌體可以將miR-133b轉移至神經細胞促進IS后神經功能的恢復。誘導腦血管生成是改善IS損傷后功能恢復的關鍵。攜帶miR-181b的脂肪干細胞外泌體可以通過下調褪黑素7(TRPM7)水平促進體外缺氧損傷后腦微血管內皮細胞的血管生成[19]。炎癥在IS的發病機制中起重要作用，抗炎是腦卒中治療的重要靶點。Jiang等人[20]通過體內外研究發現負載miR-30d-5p的脂肪干細胞外泌體可以抑制自噬介導的小膠質細胞向M1極化，抑制炎癥反應，減少梗死面積。環狀RNA(Circ RNA)是一種分布廣泛、細胞功能多樣的內源性非編碼RNA的新成員。研究顯示外泌體負載Circ RNA SCMH1傳遞增強了IS模型的神經可塑性，抑制了膠質細胞的反應性和外周免疫細胞的浸潤，促進了IS后的功能恢復[21,22]。

除了上述提到的RNA，外泌體還可以通過遞送蛋白質、藥物和激素等來參與IS治療。如，來自血漿的外泌體可以遞送熱激蛋白70(HSP70)至腦缺血區域，抑制HSP70介導的活性氧生成，減少BBB破壞并防止線粒體損傷保護缺血再灌注損傷后的腦組織[23]。外泌體可以將藥物依達拉奉輸送到IS大鼠的缺血側，并靶向神經元和小膠質細胞減少神經元死亡抑制神經炎癥[24]。同樣，運載褪黑素的外泌體也被證明對缺血誘導的炎癥反應和炎癥小體介導的細胞凋亡有很好的治療作用[25]。

綜上，外泌體通過裝載某些特定內含物,如microRNA、Circ RNA、蛋白質等在神經、血管生成及炎癥方面來影響IS的治療和預后，很多干細胞來源的外泌體發揮了比干細胞本身更具優勢的治療作用，未來或許能為發揮干細胞治療更大的潛力。但目前大部分研究還只在細胞和動物模型階段進行，從臨床試驗層面來探討外泌體承載的藥物對IS的療效研究亟待開展。

3.2 腦出血與蛛網膜下腔出血 腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是卒中最具破壞性的亞型，占所有卒中患者的10%～15%[26]。Zhang等人[27]發現裝載miR-21的MSCs-外泌體可以為ICH的治療提供一種新的方法，減輕ICH后繼發性損傷引起的神經元死亡和腦血腫。富含miR-146a-5p的MSCs-外泌體可以減少腦出血后的神經元凋亡，抑制小膠質細胞M1極化，從而保護和改善損傷后的神經功能[28]。蛛網膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是ICH的一種常見類型，外泌體介導的miRNA遞送也為SAH的治療提供了新的方向。例如，在體內用miR-206-knockdown修飾的外泌體治療后,通過靶向腦源性神經營養因子，可以治療SAH后的神經功能缺損和腦水腫并抑制神經元凋亡[29]。Sun等人[30]發現miR-630高表達修飾的外泌體可以逆轉SAH后內皮細胞屏障功能的異常。

3.3 腦動脈粥樣硬化 腦動脈粥樣硬化是腦血管疾病的主要原因。參與動脈粥樣硬化的大多數細胞可以產生外泌體。因此，外泌體介導的miRNA或反義miRNA傳遞可被視為治療腦動脈粥樣硬化的工具。例如，miR-126、miR-145和miR-155都有希望用治療腦動脈粥樣硬化，miR-126過表達介導的內皮細胞外泌體具有抗動脈粥樣硬化作用[31]，內皮細胞中過表達剪切反應轉錄因子Kruppel樣因子2(KLF2)的外泌體通過輸注ApoE-/-小鼠可減輕動脈粥樣硬化斑塊[32]。然而，使用外泌體進行腦動脈粥樣硬化的治療性輸送仍處于初步階段，要想發揮外泌體在腦動脈粥樣硬化治療上更大的潛力還需要更多的努力。

3.4 顱內動脈瘤 顱內動脈瘤(intracranial aneurysm,IA)的自發破裂是患者發病和死亡的主要原因。目前顯微手術夾閉術及血管內介入栓塞術是預防IA的主要臨床治療手段。但是，對于具有高手術風險或無法手術的IA患者，則需要開發非手術創新療法。第一個關于外泌體對IA破裂治療效果的研究報道是由Liu等人[33]提出的，研究發現在IA的小鼠模型中靜脈應用MSC-外泌體可將IA破裂率降低39%。在用外泌體處理的肥大細胞中也觀察到前列腺素E2(PGE2)產生和其受體EP4表達的上調。而在小鼠中對外泌體施用選擇性EP4拮抗劑可消除外泌體對IA破裂的治療作用。這提示外泌體介導的特定種類的表面受體或蛋白質的轉移可能是外泌體對IA治療作用的潛在機制。

3.5 腦小血管病 腦小血管病(cerebral small vessel disease,CSVD)是一類廣泛的腦血管疾病，主要影響具有多種不同病因的穿孔小動脈，毛細血管和小靜脈。是老年人認知能力下降的主要原因[34]。CSVD的病理生理機制尚不清楚。關于外泌體在CSVD中的治療應用也甚少，迄今為止，僅Josie C等人[35]報道在CSVD患者中發現循環外泌體中miR-17家族的多個miRNA的表達增加，但其在CSVD中的作用機制還不明確。因此，進一步闡明miR-17家族在CSVD的作用機制對CSVD的診斷和治療十分重要，未來可能是通過外泌體藥物遞送治療CSVD的新靶點。

4 總結與展望

綜上所述，外泌體作為一種天然、新穎的藥物遞送載體，為藥物進入中樞神經系統開辟了一條新途徑。首先，外泌體的粒徑很小，并且對于血腦屏障具有很高的滲透性。其次，外泌體是內源性物質，可以從患者體內分離出來，因此大大降低了毒性和免疫原性的風險。此外，來自特定細胞的外泌體包含天然治療分子，這對于闡明發病機理和發現天然藥物具有重要意義。但是，要將外泌體作為腦部藥物遞送載體應用于臨床實踐仍然存在許多需要解決的問題。首先，外泌體所遞送藥物的有效性和安全性，其獲得的便捷性和經濟性，以及體內使用的穩定性和安全性是解決問題的關鍵。此外，對于腦中外泌體是如何實現細胞間通訊以及如何進入大腦并將其貨物運送到中樞神經系統的機制還不夠清楚。闡明上述機制將對外泌體介導的腦部藥物遞送和腦血管疾病治療產生重要影響。目前，解決上述問題以及如何發揮外泌體最大的臨床潛力仍然需要多學科的共同努力。