中成藥DNA提取方法的研究進展

景曉彤 黃 勇 黃玉婷 蔡 毅

廣西中醫藥大學藥學院，廣西南寧530200

中成藥常見的傳統劑型主要有散劑、膏劑、丸劑、酒劑、茶劑、丹劑和錠劑等[1]。隨著現代科技不斷發展和突破，在中醫藥理論指導下，中成藥劑型取得了很大的改良和提升。現代新劑型取代傳統劑型成為臨床常用劑型，包括注射劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑、口服液、濃縮丸和微丸等。中成藥的品種數目很多，提取工藝復雜，鑒定難度不斷加大，因此需要更為科學、嚴謹、客觀的中成藥鑒定技術，才能滿足現代劑型中成藥鑒定的需要。《中華人民共和國藥典》（2020年版）[2]收載用于中成藥鑒別的方法主要有薄層色譜法、顯微鑒別法、熒光法、沉淀法、顯色法、升華法、燃燒法、結晶法等。近年來，由于DNA分子標記技術具有靈敏度高和特異性強等特點，成為國內外中藥材鑒定方面的研究熱點[3-10]，但是分子鑒定技術應用于中成藥鑒定方面的研究較少。

中成藥DNA提取質量是開展中成藥分子鑒定等研究的前提，同時也關系到中成藥基因文庫的建立以及分子克隆、高通量測序等技術的研究。在中成藥DNA提取過程中，提取方法、純化技術等對中成藥DNA質量有較大的影響。因此，本文對近些年來中成藥的DNA提取方法（CTAB法、SDS 法、試劑盒法、磁珠法、乙醇沉淀法）進行系統整理，為中成藥分子鑒定深入研究提供理論參考。

1 DNA提取及純化原理

1.1 破碎細胞

將植物或動物的組織在液氮中研磨。液氮的溫度低至-196℃，既能使各組織成分不易被破壞或者降解，又能使組織變硬，質脆，易于研磨。經液氮速凍后，破胞效果更好，能有效釋放細胞內物質，同時又可終止細胞內外的一切生物反應，避免DNA酶發生降解，維持基因組DNA的穩定。

1.2 DNA的獲取

在細胞核中，DNA存在的形式是和組蛋白結合形成染色質，而離子型表面活性劑如溴化十六烷三甲基胺（sodium dodecyl sulfate，SDS）、十二烷基硫酸鈉（cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）等能有效破壞細胞膜，與核酸形成復合物，通過離心的方法，即可使DNA與大分子物質分開，釋放出來。

1.3 抽提法去除雜質蛋白質

為去除雜質蛋白質獲取DNA，通常采用酚氯仿法單獨抽提或反復抽提[11-13]。其原理是細胞核中的DNA通常與蛋白質結合以復合物的形式存在，而利用苯酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1，v/v）或氯仿∶異戊醇（24∶1，v/v）等有機混合液，可使蛋白變性留在有機相或者中間相中，DNA則留在水相中，可以有效去除雜質蛋白質。

1.4 抗氧化法去除次生代謝產物

DNA的提取過程，常夾雜細胞次生代謝產物，如多酚、多糖、色素等，可與DNA共沉淀，形成難溶且易褐變的膠體，使DNA不易分離提取[14]。故提取過程中，應添加聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、β-巰基乙醇、抗壞血酸等抗氧化劑，避免次級代謝產物與DNA形成膠體，影響DNA的提取進程。

1.5 核糖核酸酶（RNase）消化去除RNA

為獲取高質量的DNA，應盡可能地去除其中的RNA。RNase是一種核酸內切酶，可水解RNA，而對DNA無影響，故添加RNase有效去除DNA樣品中的RNA，獲取高質量的DNA。

2 常用中成藥DNA提取方法及特點

中成藥DNA提取是基于中成藥中藥材成分，即動植物等組織的DNA提取。中成藥制劑一般分為兩大類：一類是原粉末入藥，如丸劑、散劑；一類是藥材經過深加工入藥，如液體制劑、顆粒劑。中成藥在制劑過程中，因制劑工藝的要求，需要添加相應的輔料，如淀粉、糊精、蜂蜜、硬脂酸鎂和蔗糖等，并按藥用處方和質量標準等規范進行深加工，導致多數DNA已降解，僅存部分片段，給中成藥的DNA提取帶來較大的難度。中成藥DNA的提取方法很多，并各具特點，目前固體劑型的中成藥多采用CTAB法、SDS法、磁珠法試劑盒；液體劑型的多采用乙醇沉淀法[15]。

2.1 CTAB法

CTAB法屬于陽離子去污劑，它可以使細胞膜溶解，并與核酸形成復合物。它溶于高鹽溶液（0.7 mol/NaCl），在低鹽溶液（0.3 mol/NaCl）中，通過離心與蛋白質、多糖類等進行分離。加入乙醇時，核酸形成沉淀，CTAB溶于乙醇[16-17]。CTAB法常用的操作步驟：將樣品在液氮中研磨，加入2×CTAB（預熱）和β-巰基乙醇，65℃水浴1～2h，每15分鐘震蕩1次。冷卻至室溫，12 000 r/min，離心20 min，取上清液，加入等體積的預冷氯仿-異戊醇（24 ∶ 1），抽提 10 min，12 000 r/min，離心 15 min，重復3次。取上清液，按上清液和異丙醇為1∶0.7的體積比例加入異丙醇，室溫放置1 h，沉淀DNA。取沉淀物再用70%乙醇洗滌2次，風干后溶于TE（tris-EDTA buffer solution）緩沖液中-20℃保存。

中成藥制劑時通常會添加大量的糖，多糖類輔料的添加以及深加工是影響DNA提取質量的重要因素，CATB法提取中成藥DNA的優勢在于能夠很好地去除多糖，并且操作步驟簡單。因此CTAB法為首選方案[18]。程春松等[19]使用中成藥和保健品中常用的輔料（如淀粉、蔗糖、葡萄糖等）模擬CTAB法提取DNA過程，發現使用甲醇作為沉淀試劑優化傳統的CTAB法，可以較好地克服中藥制劑中淀粉對DNA提取的不利影響，可以有效地實現基于DNA的中藥制劑分子鑒定。茍惠等[20]采用傳統CTAB法、SDS法、磁珠法以及改良CTAB法對10種含當歸的中成藥進行DNA提取，發現利用改良CTAB法可獲得純度較高，質量較好的DNA。

2.2 SDS法

SDS屬于陰離子去污劑，可使細胞膜和核膜破裂，并與核酸形成復合物。再加入酚和氯仿等表面活性劑，使蛋白質變性，通過離心可與蛋白質、多糖類等物質分開，最后加入乙醇，沉淀DNA[21-22]。SDS法常用的操作步驟，在樣品中加入液氮研磨至粉末狀，加入20% SDS裂解液，65 ℃保溫，小幅度搖晃以充分混勻（不可強烈震蕩以防DNA斷裂），加入等體積的預冷氯仿-異戊醇（24∶1）抽提10 min，12 000 r/min，離心15 min，重復3次。取上清液，加入醋酸鉀溶液（KAc，5 mol/L），充分混勻，冰上放置20～30 min，12 000 r/min，離心 20 min，取上清液，按上清液和異丙醇為1∶0.7的體積比例加入異丙醇，充分混勻，置于冰箱冷凍層沉淀30 min，12 000 r/min，離心10 min，即得DNA沉淀，風干，溶解于ddH2O或TE溶解中-20 ℃保存。

Coghlan等[23]采用SDS法對牙痛一粒丸等15種中成藥中的原料藥材進行了DNA提取，發現葉綠體片段trn L適用于這15種中成藥中原料藥材的基原鑒別。Cheng等[24]采用SDS法對不同廠家的六味地黃丸做了DNA分子提取，成功地鑒定出處方物種，并在部分樣品中檢測到處方外物質，如番瀉葉、南瓜、芍藥等。Coghlan等[25]采用SDS法對26種中藥制劑進行DNA提取，均可獲得相應的動植物特征DNA。

2.3 DNA試劑盒法

試劑盒是將組織分散成單個細胞，并使細胞膜與核膜破碎，釋放出染色體，然后除去與DNA結合的蛋白質。DNA試劑盒法由試劑盒廠家提供，具體步驟按試劑盒的說明書進行操作。王麗麗[26]利用DNA提取試劑盒對啟脾丸、人參健脾丸、人參歸脾丸、蛇膽川貝膠囊4種含有名貴中藥材的中成藥進行DNA提取，在利用CA3吸附柱吸附DNA時，將3個重復富集到一個吸附柱上，提取DNA。Jia等[27]利用試劑盒法提取中藥益母丸的DNA并對提取步驟進行了改良，獲得了質量較高的DNA。Xin等[28]把《中華人民共和國藥典》的DNA提取方法和試劑盒法結合起來進行了改良，成功提取中國傳統中成藥九味羌活丸的基因組DNA。石林春等[29]采用自動核酸提取儀和MagCore ?Genomic DNA Plant Kit提取方法對3份不同批次的如意金黃散提取基因組DNA，成功檢測出除厚樸外的全部處方成分。

2.4 磁珠法試劑盒

磁珠法的原理是在特定的條件下，使用不同的細胞裂解液裂解細胞，讓DNA分子游離出來。而磁珠表面有特定的官能團吸附核酸，帶負電的DNA可以被吸附到磁珠表面，然后在外磁場的作用下，磁珠與裂解液分開。進而對磁珠進行目的物質的分離純化，獲得純化核酸[30-31]。磁珠法中大多數都包括了細胞裂解、酶處理、核酸與其他生物大分子物質分離、核酸純化等幾個主要步驟，每個步驟可由多種不同方法單獨或者聯合實現。田曉軒等[32]利用磁珠法動物基因組試劑盒抽提出中成藥大黃蟄蟲丸的DNA，并以16S rRNA、trn L、Mini-barcode為靶標進行熒光定量PCR，從23條克隆測序結果中解析到蠐螬、虻蟲、甘草及桃仁或苦杏仁等中藥成分。

2.5 乙醇沉淀法

乙醇能夠消除核酸的水化層，使帶負電荷的磷酸基團暴露出來。Na+之類的平衡離子能夠與這些帶電基團結合，在沉淀形成部位降低多核苷酸鏈之間的排斥作用。因此只有在陽離子的量足以中和暴露的磷酸殘基的電荷時才會發生乙醇沉淀。乙醇沉淀法的常用操作步驟：加入1/10體積的乙酸鈉（3 mol/L，pH=5.2）于DNA溶液中充分混勻，使其最終濃度為0.3 mol/L；加入2倍體積預冷的乙醇再次充分混勻置于-20℃中15～30 min；12 000 r/min，離心10 min，移除上清液，吸除管壁上所有的液滴；加入1/2離心管容量的70%乙醇，12 000 r/min，離心2 min，移除上清液，吸除管壁上所有的液滴；待室溫下將開蓋的EP管中殘留的液體揮發；加適量的ddH2O溶解DNA沉淀。Chen等[15]用經典CTAB法從固體樣品（根粉、片劑和藥丸）中提取基因組DNA，對液體樣品（口服液和注射劑）進行乙醇沉淀。在口服液中未經純化直接通過乙醇沉淀法提取的DNA是深棕色和黏稠的，大多數不能PCR擴增。純化后的DNA顯示正常的顏色和黏度，可以通過PCR有效的擴增。

3 展望

中成藥DNA的提取是中成藥分子生物學研究的基礎，只有獲取高質量的DNA才能更好地開展后續的研究[33]。近年來，雖然中藥分子鑒定取得了快速發展，特別是2020年版《中華人民共和國藥典》增訂了聚合酶鏈式反應（PCR）法通則，進一步促進了中藥分子鑒定技術的深入和普及[34-35]，然而對于中成藥的分子鑒定研究報道相對較少，獲取高質足量的DNA較為困難是其難以采用分子鑒定技術的重要原因。總之，中成藥DNA的提取，需要根據中成藥中不同的藥材以及不同的制劑類型設計且優化相關的DNA提取方法。此外，經加工的肉類食品，血清和組織的DNA雖然降解都較為嚴重，但依然可以提取高質量的DNA。因此，除了上述提到的固體劑型的中成藥多采用CTAB法、SDS法、磁珠法試劑盒，而液體劑型的多采用乙醇沉淀法外，將來中成藥DNA的提取方法研究可以借鑒食品科學、法醫及考古等學科，如硅柱離心法[36]、酚-氯仿法[37]、直接擴增法[30]。這些方法也將為中成藥DNA提取提供參考。