補陽還五湯防治腦缺血再灌注損傷的研究進展

單玉棟，高維娟

(河北中醫學院 河北省心腦血管病中醫藥防治研究重點實驗室，河北 石家莊 050091)

腦卒中是臨床常見病，具有致死率高、致殘率高和易復發的特點，其中缺血性腦卒中的發病率約占全部腦卒中的70%[1]。隨著社會不斷發展，人們日常生活飲食習慣的改變，腦卒中的發病率不斷提高，缺血性腦卒中的預防和治療是臨床亟須解決的重要問題[2]。梗死組織周邊缺血半暗帶的恢復再通是缺血性卒中的首選治療方法[3]。然而，腦血流再灌注會引起一系列的病理過程，導致進一步的損傷，這被稱為腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)。研究發現，補陽還五湯對CIRI有較好的療效，現就補陽還五湯復方及單藥組分在CIRI中的作用機制進行如下綜述。

補陽還五湯出自清代名醫王清任的《醫林改錯》，其方根據氣虛血瘀理論而立，全方共7味藥，由黃芪、桃仁、紅花、當歸尾、地龍、川芎、赤芍組成。方中重用黃芪為君藥旨在補氣行血，又配伍當歸尾、赤芍、川芎、桃仁、紅花、地龍等藥物以補氣通絡、活血化瘀，廣泛應用于缺血性腦卒中的臨床防治。

1 補陽還五湯復方在防治CIRI中的作用

1.1 抑制興奮性氨基酸毒性

興奮性氨基酸(excitatory amino acids，EAA)毒性是指各種因素過度激活EAA轉運體受體，使其功能亢進導致神經元異常興奮，最終導致細胞死亡的過程[4]。EAA主要包括谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)等，存在于神經元胞體內和神經元突觸末梢，是神經系統的重要興奮性神經遞質，缺血時中樞神經系統(CNS)釋放大量的Glu在CIRI發病機制中起到重要的作用[5]。EAA對神經系統的損傷機制主要可以概括為：①興奮性氨基酸轉運體(EAATs)受到抑制，CNS對谷氨酸清除能力減弱，從而使谷氨酸大量積累對神經元造成損傷[6];②激活N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate receptor，NMDA)受體，使Ca2+內流導致細胞內鈣超載進一步造成遲發性神經元損傷[7];③激活代謝性谷氨酸(metabotropic Glutamate，mGlu)受體，使細胞通透性發生改變，大量離子進入細胞，進而導致水腫對細胞造成損傷[8]。YU等[9]通過研究補陽還五湯血清(BYHWD-CS)對氧糖剝奪/復氧復糖(OGD/R)后星形膠質細胞(astrocyte，AC)谷氨酸轉運體蛋白(GLT-1)和谷氨酰胺合成酶(GS)蛋白水平的影響，發現BYHWD-CS能提高AC中GLT-1和GS的表達水平，降低培養液中Glu的濃度，提示補陽還五湯可以降低CIRI后Glu水平。亦有研究[10]發現補陽還五湯能夠降低腦缺血/再灌注后Glu水平、上調AC中GLT-1和GS的表達，并且垂體腺苷酸環化酶激活肽-38(PACAP-38)參與了此調節過程。

1.2 抑制鈣超載

缺血/再灌注會導致細胞內Ca2+分布紊亂，細胞內Ca2+濃度異常升高，這就被稱為鈣超載。缺血/再灌注會使細胞內L-型鈣通道、Na+/Ca2+交換蛋白、Na+/H+交換蛋白、溶酶體等功能異常，進一步導致細胞蛋白水解、細胞過度收縮和線粒體衰竭，最終導致細胞損傷。鈣超載既是各種因素造成的綜合結果，也是造成CIRI過程中各種因素作用的共同通路。細胞內Ca2+超載對腦缺血/再灌注后神經元細胞的損傷機制[11]：①Ca2+大量流入細胞內，一方面造成線粒體膜損傷，另一方面抑制ATP生成造成能量供給不足，進而導致線粒體功能障礙引起神經元損傷;②導致脂質代謝紊亂，激活脂蛋白相關磷脂酶A2 (LP-PLA2)和C反應蛋白(CRP)，使細胞膜通透性和流動性增大;③導致5-羥色胺(5-hydroxytryptamine)及彈性蛋白酶釋放，造成局部血管痙攣加重腦缺血。有研究表明[12]補陽還五湯能顯著增加海馬CA1區細胞外信號調節激酶2(ERK2)和鈣調素依賴性蛋白激酶II(CaMKII)的表達，保護海馬神經元免受缺血再灌注損傷。研究人員[13]在補陽還五湯對紅核神經元L-型鈣通道(ICa-L)電流活動影響的實驗中發現，補陽還五湯中、高劑量組的開放時間、開放概率均低于模型組，提示補陽還五湯能夠抑制神經細胞ICa-L的開放防止鈣超載。

1.3 抑制自由基損傷

人體正常情況下細胞內的自由基是動態平衡的，細胞在缺血狀態下自由基的清除被抑制，而細胞缺血時自由基的產生能力反而增加，細胞缺血/再灌注后會造成自由基急劇增多對神經元造成損傷[14]。活性氧簇 (Reactive oxygen species，ROS)是一組高活性分子，是重要信號通路的調節因子。生理濃度下，ROS 作為信號分子調節細胞的生長、分化、衰老、凋亡和自噬；ROS 的病理水平一般被認為是大分子損傷的主要原因。ROS主要包括超氧陰離子羥基自由基 (HO)、烷氧基自由基 (RO)等在內的多種自由基。ROS對細胞造成損害的作用機制[15]：①損傷內皮細胞，破壞血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)，使血管的反應性改變。②發生脂質過氧化反應，造成細胞膜、細胞器膜等膜結構變性。SHEN等[16]通過建立過氧化氫(H2O2)誘導的內皮細胞氧化應激模型，探討了補陽還五湯對H2O2誘導的人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)凋亡的保護作用及其機制，發現補陽還五湯能明顯抑制細胞內ROS的產生，提高超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低血清丙二醛(MDA)水平，從而抑制H2O2誘導的HUVECs凋亡。YANG等[17]通過新生大鼠坐骨神經Schwann細胞進行實驗，發現補陽還五湯能夠提高H2O2損傷Schwann細胞的生存率，并且提高了SOD活性，降低了MDA含量。綜上，補陽還五湯具有抗氧自由基損傷，防治CIRI的作用。

1.4 減輕炎癥反應

腦缺血引起的強烈炎癥反應包括炎性細胞的黏附、激活和遷移，以及細胞黏附分子和細胞因子的表達上調。核轉錄因子kappaB(NF-κB)最早是由David Baltimore發現的[18]，該蛋白家族可以選擇性地與B細胞κ-輕鏈增強子結合，進而調控眾多基因的表達。NF-κB是起始于細胞外終止于細胞核的級聯反應的一部分。NF-κB是細胞內重要的轉錄調節因子，當細胞受到如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、淋巴毒素、白細胞介素-1β(IL-1β)等的刺激時，該通路會被激活進而誘導多種因子的表達。NF-κB被激活后會介導促炎細胞因子、趨化因子和誘導性酶如誘導型一氧化氮合酶(INOS)和環氧合酶-2(COX-2)等的產生[19]，進而造成細胞功能和結構的損傷[20]。研究人員[21]通過研究補陽還五湯對腦缺血大鼠海馬組織的影響，發現補陽還五湯能明顯降低NF-κB、TNF-α、IL-1β、Toll受體4(TLR4)及MyD88蛋白(myeloid differentiation factor 88)的表達水平，提示補陽還五湯通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路及炎癥因子的表達對腦缺血神經元起到保護作用。LIU等[22]研究發現補陽還五湯可以通過脂肪細胞核因子NF-kBp65通路抑制細胞間黏附分子-1(ICAM-1)和血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)誘導的血管內皮炎癥，提示補陽還五湯可以減輕腦缺血炎癥，改善神經功能。

1.5 抑制神經元凋亡

細胞凋亡是由體內外因素觸發細胞內預設的死亡程序而導致的細胞死亡過程，是細胞程序性死亡的形式之一。細胞凋亡的主要途徑：①線粒體通路，與細胞凋亡有關的線粒體蛋白包括：細胞色素C、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)家族、凋亡誘導因子(apoptosis inducing factor，AIF)、B細胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2，Bcl-2)家族蛋白等。細胞內外各種死亡信號可誘導線粒體釋放細胞色素C、AIF等促凋亡因子使細胞內的氧化磷酸化、電子傳遞和ATP產生等過程遭到破壞，最終導致細胞凋亡[23]。②死亡受體通路，死亡受體屬于腫瘤壞死因子受體 (TNFR)基因家族，它是一類跨膜蛋白，細胞外的死亡信號可由其轉入細胞內。劉芳等[24]研究發現補陽還五湯類方可以通過氧化應激模型細胞周期素依賴性蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase5，Cdk5)信號轉導途徑有效抑制神經元細胞凋亡，對腦缺血/再灌注后的神經細胞損傷起到保護作用。張穎等[25]通過構建大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，發現補陽還五湯能夠加強Bcl-2的表達、降低BCL2-Associated X蛋白(Bax)、半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶3(caspase-3)、半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶8(caspase-8)的表達，從而顯著減少神經細胞的凋亡。綜上，補陽還五湯能夠調節凋亡因子的表達，抑制腦缺血/再灌注后神經元細胞的凋亡。

2 補陽還五湯單藥組分在防治CIRI中的作用

2.1 黃芪

黃芪為補氣藥的代表，具有補氣升陽、利水消腫等作用，補陽還五湯中重用黃芪為君藥，補益元氣，旨在氣旺則血行，瘀去而絡通。

2.1.1 黃芪甲苷

現代藥理學研究發現，黃芪的有效活性成分之一黃芪甲苷(astragaloside IV，AST-IV)，對腦缺血/再灌注神經元損傷有多種保護作用。研究顯示[26]AST-IV可以通過抑制TLR4/MYD88/NF-κB信號通路，減少TNF-α、IL-1β、IL-6、一氧化氮合酶等的表達，同時誘導抗炎分子IL-10、精氨酸酶-1(Arg-1)的表達，減輕MG介導的神經元損傷。ZHANG等[27]發現在腦組織中AST-IV可以降低P62蛋白的表達、增加自噬相關蛋白Beclin1及微管相關蛋白1輕鏈3融合蛋白Ⅰ/Ⅱ(microtubule associated protein1 light chain 3 fusion protein，LC3I/II)的表達來平衡Bcl-2和Bax的表達，從而抑制CIRI細胞凋亡。

2.1.2 毛蕊異黃酮

現代藥理學研究證實，黃芪的另一種有效成分毛蕊異黃酮(Calycosin)同樣對CIRI有保護作用[28]。HSU等[29]研究發現Calycosin可以增加缺血性腦卒中大鼠大腦中腦源性神經營養因子 (BDNF)及其酪氨酸激酶受體B (TrkB)的表達，使MG從活化的變形狀態轉變為靜息狀態，從而減輕神經元損傷。亦有研究[30]發現Calycosin可以減輕OGD/R細胞的凋亡與氧化應激損傷。

2.2 當歸

當歸具有補血活血的作用，在補陽還五湯中為臣藥，旨在通絡活血而不傷血。

2.2.1 阿魏酸

當歸的有效活性成分之一阿魏酸(ferulic acid，FA)對神經細胞具有保護作用[31]。CHENG等[32]研究發現FA能夠上調Akt/mTOR/4E-BP1/Bcl-2抗凋亡信號，進而抑制細胞色素c /caspase-3依賴性凋亡途徑，可有效減輕大鼠MCAO模型的腦缺血損傷。CHENG等[33]研究表明FA能夠上調熱休克蛋白70(heat shock protein,HSP70)/Bcl-2介導的信號轉導，抑制Bax和AIF介導的信號通路，保護線粒體外膜完整性，從而保護缺血誘導的細胞凋亡。近期研究[34]證實FA能夠抑制Ca2+內流、減少和ROS產生，從而起到抑制神經細胞凋亡的作用。

2.2.2 藁本內酯

亦有研究表明[35]，當歸中的有效成分藁本內酯(Ligustilide)能夠保存Tight Junction蛋白和抑制HIF-1α/VEGF/Akt通路、肝組織PI3K/Akt/FoxO1通路，對OGD/R誘導的BBB細胞通透性的破壞具有保護作用。

2.3 赤芍、川芎、桃仁、紅花、地龍

方中川芎、赤芍、桃仁、紅花協同當歸祛瘀活血；地龍通經活絡，力專善走，共為佐藥。

2.3.1 赤芍

赤芍的有效成分之一芍藥苷(paeoniflorin，PF)對腦缺血/再灌注后的神經細胞損傷有保護作用。SHE等[36]研究表明PF能夠調控NLRP3介導的經典熱休克途徑，抑制接頭蛋白凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)ASC、caspase-1和IL-1β蛋白的表達，對腦缺血/再灌注后神經細胞損傷起到保護作用。ZHANG等[37]發現PF顯著降低了體內神經功能缺損評分和梗死體積，提高神經元的存活率，抑制了體外培養的神經元凋亡和神經元胞內Ca2+濃度，提示PF通過調節Ca2+/CaM依賴性蛋白激酶II/cAMP反應元件蛋白信號通路對CIRI起到保護作用。

2.3.2 川芎

川芎具有活血行氣止痛之功效，其有主要效成分川芎嗪(Ligustrazine)具有抗腦缺血的作用，其機制主要與抑制神經元凋亡、減輕炎癥等有關[38]。WANG等[39]研究發現Ligustrazine可改善腦缺血大鼠的神經功能缺損和神經元損傷，促進神經發生，上調軸突生長相關蛋白，減輕炎癥應。亦有研究表明[40]Ligustrazine通過激活PI3K/Akt通路在大鼠CIRI中發揮神經保護作用。

2.3.3 桃仁

桃仁為活血化瘀的常用藥特效藥。動脈粥樣硬化是腦血管缺血性疾病的重要病因，研究發現[41]桃仁油可以降低高脂飲食喂養的載脂蛋白E(ApoE)基因敲除小鼠的總膽固醇并且下調組織因子(TF)的表達，從而抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成。

2.3.4 紅花

紅花中的主要有效成分為羥基紅花黃色素A(hydroxysafflor yellow A，HSYA)在CIRI中具有保護作用。近期研究[42]發現HSYA具有恢復能量代謝、改善神經功能、減少腦梗死體積、減輕細胞凋亡和自噬、抑制炎癥等效應，在CIRI中起到保護作用。YU等[43]通過HSYA對MCAO大鼠JAK2/STAT3與細胞因子信號轉導抑制蛋白3 (SOCS3)信號的相互作用的研究，發現HSYA可能通過調節JAK2/STAT3和SOCS3信號通路之間的串擾而對局灶性腦缺血產生神經保護作用。

2.3.5 地龍

地龍為蟲藥，走竄力強，具有通絡的作用。研究顯示[44]地龍一方面能夠降低活性氧和線粒體超氧化物的產生，抑制炎癥性細胞因子的表達；另一方面其能有效抗凝、抑制血小板聚集、改善微循環。能有效防治CIRI，對神經細胞起到保護作用。

3 小結與展望

綜上所述，補陽還五湯復方防治CIRI的機理主要通過降低腦缺血/再灌注后Glu、Asp等的水平進而抑制興奮性氨基酸毒性；通過調節ERK2、CaMKII、ICa-L抑制鈣超載；通過抑制細胞內ROS的產生、提高SOD活性、降低MDA水平進而抑制自由基損傷；通過抑制NF-κB 信號通路及炎癥因子的表達來減輕炎癥反應；通過加強Bcl-2的表達、降低Bax、caspase-3、caspase-8的表達抑制神經元凋亡。另一方面，補陽還五湯單藥組分在防治CIRI過程中發揮重要作用，例如：黃芪中的黃芪甲苷能夠減輕MG介導的神經元損傷，毛蕊異黃酮能夠平衡Bcl-2和Bax的表達進而抑制CIRI細胞凋亡；當歸中的阿魏酸能夠抑制神經細胞凋亡，藁本內酯能夠抑制細胞通透性的改變；赤芍中的芍藥苷能夠抑制ASC、caspase-1和IL-1β蛋白的表達從而抑制細胞凋亡；川芎中的川芎嗪能夠在抑制神經元凋亡同時減輕炎癥反應；桃仁能夠抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成；紅花中的羥基紅花黃色素A能夠恢復能量謝同時減輕細胞凋亡和自噬；地龍能夠降低活性氧和線粒體超氧化物的產生等。本文就補陽還五湯防治腦缺血再灌注損傷的作用機制進行了詳細闡述，補陽還五湯復方及其單藥組分在防治CIRI過程中能夠多層次、多靶點發揮作用，為進一步防治CIRI提供了參考依據。

但是，補陽還五湯復方內包含的具體單藥組分及其作用于體內的具體靶點數量龐大且關系復雜，尚需進一步深入研究。另外，補陽還五湯目前大多數研究限于動物實驗，仍需開展大量的臨床研究，為缺血性腦病的防治提供更多的應用價值。