藏文大藏經金色經文成分及紙張微生物分析

馬燕瑩，張鳳玉，潘 皎

(1. 故宮博物院文?？萍疾浚本?100009； 2. 南開大學生命科學學院微生物系，天津 300071)

0 引 言

大藏經，又稱一切經、契經、藏經或三藏，現存的大藏經按不同書寫文字可分為漢文、藏文、巴利語三大體系[1]。藏文大藏經是翻譯成藏文的印度佛教原典和佛教著述的總集，由甘珠爾和丹珠爾兩大部分組成，藏文大藏經絕大部分是手抄本，文字典雅，用筆流暢，部分繪有精美的佛像，具有很高的藝術價值，是目前國內外學術界公認的一部具有百科全書性質的藏文古籍叢書，已成為佛學(尤其是藏傳佛學)和藏學研究最重要、最基本的資料之一[2]。

甘肅武威亦稱涼州，地處河西走廊東端，自古以來就是多民族聚居區，古絲綢之路重鎮，是較早從事佛經翻譯的地區[3]。武威作為東西方文化交流的樞紐和佛教東傳的橋頭堡，在中國佛教傳播發展史上占有重要地位[4]。據2002年出版的《武威民族宗教志》記載：歷史上涼州地區的藏傳佛教寺院多達二十余座，至民國初期尚有22座藏傳佛教寺院[5]。西夏時期，藏傳佛教在武威得以弘傳，到元明清三代達到鼎盛[6-7]。武威地區曾出土大量西夏時期的紙質文書和佛經[8]。武威白塔寺也曾發現明代漢、藏文的紙質佛經，其中以藏文大藏經最為著名[9]。

新中國成立以后，武威各寺院及藏經閣內供奉的明清時期藏文大藏經等佛教文獻典籍全部收歸博物館保管。目前，王歡歡等[10]研究發現武威市博物館館藏藏文大藏經紙張原料有亞麻、苧麻、棉花及構皮纖維，紙張以高嶺土為填料，并經靛藍染色，以天然礦物石墨材料涂敷于紙張表面，經文紙張邊框用赤鐵礦繪制，用銀泥書寫經文。龔鈺軒等[11]研究認為武威市博物館藏藏文大藏經的書寫方式主要有硬筆手寫和雕版印刷。這批大藏經數量很大，在修復過程中，出現了一批用金色文字書寫的經文。本工作選取少量脫落的金字大藏經破損殘片及粘連大藏經微生物樣品，利用光學顯微鏡觀察、掃描電鏡與能譜法、顯微激光拉曼光譜法、高效液相色譜-質譜法、微生物分離純化培養技術、分子生物學鑒定技術以及高通量測序等方法，分析其紙張和文字的成分結構以及紙張表面粘連原因與微生物種類，以期為大藏經保護材料和修復技術的選擇提供信息與依據，也為其揭展和防霉材料篩選提供評估數據。

1 樣品與分析方法

1.1 實驗樣品

金泥書寫大藏經樣品整體保存狀況不佳，紙張纖維老化嚴重，隱約可見藍色纖維，表明紙張曾經過藍色染料涂染，其上涂覆黑色顏料，并書寫金色文字。樣品表面存在粘連、蟲蛀、褪色等病害。樣品編號S1見圖1。

圖1 取樣分析之大藏經樣品S1Fig.1 Paper sample S1 for analysis

1.2 實驗儀器

1) 尼康SMZ-10型體視顯微鏡。

2) 日立公司S-3600N型掃描電子顯微鏡，分析電壓20 kV。美國EDAX公司Genesis 2000XMS型X射線能譜儀。

3) LC20AD高效液相色譜系統(日本Shimadzu公司)，包括SPD-M20A二極管陣列檢測和SIL-20AT自動進樣器；LTQ-XL線性離子阱質譜儀(美國Thermo公司)。

4) 法國JY公司(現HORIBA公司)XploRA型拉曼光譜儀：配置Olympus BX-41顯微鏡；激光波長532 nm、638 nm和785 nm。

5) 美國CLEAN公司pH30酸堿度儀。

6) PCR儀(Eppendorf)、臺式離心機(Eppendorf)、電泳儀(北京六一儀器廠)、電熱培養箱(上海一恒科技)、高溫高壓蒸汽滅菌鍋(Hirayama)、電子天平(Sartorius)。

2 結果與討論

2.1 體視顯微鏡觀察

利用體視顯微鏡觀察樣品S1形貌，結果見圖2?？梢钥闯鰳悠稴1存在粘連、纖維斷裂、褪色等病害。樣品S1表層涂有黑色顏料，并書寫金色文字，書寫材料呈顆粒狀。黑色顏料下可見藍色纖維，部分染色層已剝蝕，露出黃色的底(圖2a)。進一步放大觀察可確定黑色顏料層涂于藍紙之上(圖2b)。

圖2 樣品S1的體視顯微鏡照片Fig.2 Stereomicroscopic images of Sample S1

2.2 SEM-EDX分析

利用掃描電子顯微鏡與能譜儀(SEM-EDX)分析樣品S1金色經文書寫區域，結果見圖3和表1。鑒于金和碳元素均為主要分析對象，因此樣品既未噴金也未噴碳，將其平鋪于導電膠上。為了分析書寫區域與紙面的元素分布變化，特選取書寫區域與紙面的交界處。圖3中EDX1為金色經文書寫區域，EDX2為無文字的紙面區域，該區域顏料層老化嚴重，表面雜質顆粒較多，顏料缺失導致下層纖維隱約可見。

分析結果表明，整個區域(EDX1、EDX2)中C元素含量很高，推測所用顏料為墨。金色經文書寫區域(EDX1)的Au、Ag和Cu元素明顯較紙面區域(EDX2)更多。分析金色顆粒(EDX3和EDX4)，發現其為金銀銅合金，且保存完好未受腐蝕，合金顆粒的主要成分為：Au含量72.8%～75.6%，Ag含量22.8%～26%，Cu含量1.2%～1.6%，推斷使用的金泥純度不高。金自古為貴重金屬，經過細磨加工成為金泥，為貴重的金屬顏料[12]。書寫區域的Cl元素應該來自于腐蝕產物氯化銀(AgCl)[13]。紙張中夾雜有少量的Ca、Si、Al、K等元素，應是加入的填料，如高嶺土(Al2O3·2SiO2·2H2O)和CaCO3的混合物[10]。早在北魏時期，高嶺土就已用于紙張涂布，以提高紙張白度、平滑度和吸墨性[14]。古法造紙術中，造紙纖維類原料需經過漚制、蒸煮、曝曬、清洗、切割和舂搗等工序，去除木素與果膠，以提高纖維間的結合力，而煮料通常為石灰水[Ca(OH)2]或草木灰(K2CO3)[14]。

圖3 樣品S1的SEM-EDX分析Fig.3 SEM-EDX analysis of the cross-section of Sample S1

表1 大藏經樣品S1的掃描電鏡與能譜分析結果Table 1 SEM-EDX results of Sample S1 (%)

為了判斷S1樣品各元素的分布情況，對其元素分布進行面掃描分析(圖4)。結果顯示，相對于紙面區域，金字書寫區中的Au、Ag和Cu元素均有明顯的富集，紙面區域中Al、Si、K、Ca元素有不顯著的增多趨勢。樣品元素面掃描結果均與SEM-EDX數據相吻合。

圖4 樣品S1的元素分布面掃描圖Fig.4 Element mapping of Sample S1

2.3 液相色譜-質譜分析S1藍色染料

由于在SEM-EDX分析中未發現藍紙的顯色元素，因此推測使用了有機染料。利用高效液相色譜系統分析樣品S1的藍色染料纖維，結果見圖5。

分析結果顯示，在600 nm檢測波長下出現兩個藍色化合物，分別為保留時間在14.2 min和14.7min的靛藍和靛玉紅，表明樣品S1曾用靛青染料染色。常見的靛青染料來源有菘藍、馬藍、蓼藍、豆藍與木藍等[15]。靛青在我國有很長的使用歷史，其提取需在加熱情況下加入石灰堿[Ca(OH)2]。如溫度適中，則生成藍色的靛藍素；如果溫度過高，堿性過強，則生成偏紅色的靛玉紅。后者是靛藍的同分異構體。因此，靛青實為靛藍和靛玉紅的混合物[16-18]。

2.4 拉曼光譜分析

為進一步驗證SEM-EDX和高效液相色譜系統的檢測結果，利用顯微激光拉曼光譜分析藍色染料和其他顏料，結果見圖6。分析結果表明S1的藍色紙張采用靛青(C6H10N2O2)染色，紙上涂料為炭黑(墨)。

圖5 樣品S1藍色纖維高效液相色譜-質譜分析Fig.5 HPLC-MS analysis of Sample S1

圖6 樣品S1藍色染料與黑色顏料的拉曼光譜圖Fig.6 Raman spectra of the blue and black pigments of Sample S1

2.5 紙張酸堿度分析

為檢測樣品S1紙張的酸化程度，將其表面浸濕，用酸堿度儀多點檢測，測得其pH值均在7.0～7.5之間。表明樣品基本在中性范圍，未酸化。

2.6 微生物病害分析

此批紙質大藏經表面存在大量微生物損害痕跡，因此從大藏經表面采集微生物樣品2份，編號B1(粘連殘片)和B2(綠色霉斑)，采用光學顯微鏡觀察、電子顯微鏡觀察、微生物分離純化培養和高通量測序等方法，盡可能全面地了解大藏經表面微生物的信息，包括細菌和真菌的種群類型和比例等，為大藏經揭展和防霉材料篩選提供評估數據。

2.6.1掃描電子顯微鏡觀察 利用SEM觀察樣品S1，結果見圖7?？梢钥闯黾垙埨w維間散布有大量孢子，這是微生物繁殖的結果，微生物及其分泌物和孢子會造成部分纖維粘連[19]。

圖7 樣品S1表面微生物的SEM觀察Fig.7 SEM images of microorganism of Sample S1

2.6.2光學顯微鏡觀察 利用光學顯微鏡觀察樣品B2，結果見圖8。鏡檢結果顯示樣品中主要的微生物形態呈菌絲狀，菌絲直徑為7～10 μm，為絲狀真菌。

B2：真菌菌絲 圖8 樣品B2表面微生物顯微形態觀察Fig.8 OM image of microorganism of Sample B2

2.6.3樣品B2主要真菌的純化培養及分子鑒定

1) 樣品B2主要真菌的分離純化根據鏡檢結果(圖8)，設計分離純化培養真菌的PDA培養基，將樣品B2的綠色菌斑采用無菌操作技術，挑取少許在PDA+Amp(100 μg/mL)培養基上，30 ℃培養3 d。真菌的分離純化使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(Potato Dextrose Agar，PDA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 L(自然pH值)。

將樣品B2在培養基上初步培養的菌落進一步分離純化，30 ℃培養3 d。結果如圖9所示。從平板上的菌落形態觀察，發現這種真菌菌落均為綠色絨毛狀，菌絲生長較致密，邊緣較明顯，菌絲呈綠色，分為氣生菌絲和營養菌絲，部分氣生菌絲會分化出孢子囊的無性繁殖體結構。菌絲多分枝，菌絲直徑7～10 μm。

圖9 樣品B2菌落平板形態和顯微形態Fig.9 Fungal colony and its OM image of Sample B2

2) 樣品B2主要真菌的分子鑒定。針對樣品B2中分離純化的單菌落，收集菌絲，提取總DNA，進行分子生物學的鑒定。選用擴增真菌ITS間隔區的通用引物ITS1-ITS4，進行PCR擴增，引物序列如下所示：

ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’

ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

反應體系：模板4 μL，10×Taq酶buffer 5 μL，dNTP(2.5 mM)4 μL，引物(5 μM)各2 μL，Taq酶(5 U/uL)0.5 μL，加滅菌ddH2O至50 μL。

條件：95 ℃，5 min；(95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，1 min)×30循環；72 ℃，10 min。

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。將純化后的PCR產物送蘇州金唯智生物科技有限公司進行測序，將測序結果提交到GenBank，采用NCBI Blast功能進行同源比對，判斷待測微生物的種屬。將純化后的PCR產物測序，并進行序列比對，經鑒定為煙曲霉(Aspergillusfumigatus)。

2.6.4樣品B1高通量測序分析 將樣品B1(粘連殘片)用于克隆文庫檢測。表2為樣品B1中真菌菌群的高通量測序結果。

分析結果表明樣品B1中毛殼菌屬(Chaetomiumsp.)比例為44.92%，為主要病害真菌，其次是曲霉屬(Aspergillussp.)、毛霉屬(Mucorsp.)和白僵菌屬(Beauveriasp.)等。

眾所周知，館藏文物因真菌的腐蝕而受損的現象十分普遍，而一些特殊質地的文物如棉、麻、皮毛、紙、絲綢等更容易被真菌所侵蝕。真菌的休眠期孢子普遍存在于文物上，并可萌發和繁殖，真菌菌絲在文物上有很強的增殖能力，菌絲可以深入有機質文物組織內部，對文物造成機械損傷[20]。真菌所分泌出的各種酶也是造成文物破壞的重要因素。微生物酶由活細胞產生，是一種活性蛋白質，對含有蛋白的絲綢文物具有降解作用。除此之外，真菌產生的羧酸(例如草酸、檸檬酸、琥珀酸、酒石酸)、色素等也會對文物造成化學損傷或者影響文物的美觀性[21]。

表2 粘連大藏經樣品B1中真菌的組成比例Table 2 Proportion of fungi in Sample B1 (%)

2.7 粘連經頁揭展建議

此次修復運用傳統古籍修復技法中的干揭和濕揭兩種方法，揭開了約80%的經頁。干揭法適用于粘連程度較輕的經頁。用竹啟子插入經頁粘連的縫隙處，輕輕深入，使經頁縫隙逐漸擴大，直至完全揭開，見圖10a。濕揭法適用于粘連程度較重的經頁。首先將粘連程度較重的經頁放入純凈水中浸泡5～6 h，取出后用毛筆蘸水逐頁揭開，見圖10b。這批大藏經中靛藍染色的紙張固色性都比較好，沒有遇水脫落現象。對于有金粉書寫經文的紙張，考慮到其珍貴性，同時其數量也比較少，一般用宣紙上下托覆后在蒸鍋中蒸10 min左右，然后揭取或展平。

約有10%經頁粘連嚴重，使用傳統方法未能奏效。根據檢測和拆解試驗的結果，選用蛋白酶K溶液作為助揭劑。蛋白酶K是由林伯氏白色念球菌(TritirachiumalbumLimber)分泌的一種重要的絲氨酸蛋白酶[22-23]，因其能降解角蛋白而被命名為蛋白酶K[24]。蛋白酶K已廣泛應用在皮革、毛皮、絲綢、醫藥、食品、釀造等方面。pH范圍為7.5～12時蛋白酶K顯示最佳活性[22]。蛋白酶K的有效反應溫度為25～45 ℃，在50 ℃或更高的溫度蛋白酶K會迅速降解[25-27]。為此，此次修復將蛋白酶K的工作溫度設定在30 ℃，濃度為1 mg/mL。

經上述方法揭取后，仍有約10%粘連異常嚴重的經頁無法揭開。經與相關專家討論取得共識，目前應盡量保留文物信息，待今后有更好的保護修復技術時再做處理。

圖10 粘連經文的揭展Fig.10 Seperation of stuck paper

3 結 論

1) 甘肅省武威市博物館藏金色經文大藏經樣品S1以靛青染色，并以墨涂覆紙張表面。

2) 樣品S1金色書寫材料為金銀銅合金顆粒，其中Au含量72.8%～75.6%，Ag含量22.8%～26%，Cu含量1.2%～1.6%，所用金泥純度不高。

3) 金色經文大藏經紙張的pH值在7.0～7.5之間，未酸化。

4) 金色經文大藏經樣品S1紙張纖維間散布有大量孢子，這是微生物繁殖的結果，微生物及其分泌物是紙張粘連的原因。

5) 對樣品B2進行微生物純培養，獲得純培養物，經分子生物學鑒定為煙曲霉(Aspergillusfumigatus)。

6) 對樣品B1進行免培養的分子生物學鑒定，鑒定結果表明主要病害真菌為毛殼菌屬(Chaetomiumsp.)， 比例為44.92%；其次是曲霉屬(Aspergillussp.)、毛霉屬(Mucorsp.)和白僵菌屬(Beauveriasp.)等。

致 謝：本工作得到北京停云館文化投資有限公司王治濤先生，中國絲綢博物館周旸研究員與劉劍副研究員、中國文化遺產研究院葛琴雅研究員的幫助，在此表示感謝！