改良的qPCR檢測水痘-帶狀皰疹病毒的臨床應用*

鐘婷婷，任虎，席瑞闌，許飏

[1.綿陽市第三人民醫院（四川省精神衛生中心） 皮膚科，四川 綿陽 621000；2.西南醫科大學附屬醫院 皮膚科，四川 瀘州 646000]

水痘-帶狀皰疹病毒（varicella-zoster virus, VZV）可導致水痘和帶狀皰疹[1]，監測VZV 有助于評價其傳染性[2]。VZV 是醫院感染的常見病毒之一，而血液病毒檢測有助于早期診斷[3-4]。早期持續性監測外周和中樞VZV DNA 水平變化，對判斷病毒性腦膜炎和病毒性腦炎病情進展十分重要[5]。目前qPCR 試劑盒成本高昂，難以得到普遍應用[6]，急需一種快捷、經濟、有效的VZV 檢測方法。有研究利用巢式PCR 從病毒感染宿主血液中得到DNA，經純化后作為標準品用于病毒核酸的qPCR 檢測[7]。本研究據此設計一種改良的qPCR，與VZV DNA 試劑盒進行對比，并進一步分析其臨床應用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年5月—2017年7月在西南醫科大學附屬醫院就診的帶狀皰疹患者31例。診斷標準參考《中國臨床皮膚病學》[8]。患者均無認知障礙，同意參與本研究，并接受標準伐昔洛韋抗病毒治療方案。伐昔洛韋（西班牙Glaxo Wellcome, S.A.公司，批號H20150209）1 000 mg/次，3 次/d，連續7 d）[9]。

1.2 主要試劑及儀器

血液/細胞/組織基因組DNA 提取試劑盒（離心柱型）及引物購自北京天根生化科技公司，PCR Master Mix（2X）試劑購自北京博邁德生物公司，瓊脂糖凝膠試劑購自北京沃比森科技有限公司，VZV 的qPCR 試劑盒（Taqman 探針法）購自上海之江生物科技股份有限公司。實時熒光定量PCR 儀購自美國ABI 公司，設計引物的Primer Premier 6.0 軟件購自美國Premier 公司。

1.3 標本采集和處理

采集帶狀皰疹患者的皰液標本，利用離心柱法提取其DNA。采集臨床VZV 感染患者的外周血標本，分離出外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）和血漿，用離心柱法提取PBMC 和血漿中的DNA。

1.4 巢式PCR 和凝膠電泳制備標準品

標準品引物1 正向引物：5'-GATCTCGGGT TCGCCTTTA-3'，反向引物：5'-CCAGAGCATTCGC GTTGTA-3'，長度489 bp；標準品引物2 正向引物：5'-ATCTCGGGTTCGCCTTTAC-3'，反向引物：5'-TGGC ATAACACCACCGTCT-3'，長度404 bp；標準品引物3正向引物：5'-CTCGGGTTCGCCTTTA-3'，反向引物：5'-ACACCACCGTCTAGTCTTAA-3'，長度395 bp。巢式PCR 反應體系：皰液DNA 樣品5μl，正反向引物各1μl，2×MasterMix 12.5μl，ddH2O 5.5μl；反 應條件：94℃預變性3 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸5 min，共30 個循環。DNA 產物在4℃下保存。瓊脂糖凝膠電泳步驟：配置1.5%瓊脂糖，裝入錐形瓶放入微波爐中加熱溶解，待冷卻后倒入模具，常溫下放置30 min，拔除模具卡槽并將瓊脂糖凝膠放入1×TAE，加入Marker Ⅰ和DNA 產物在120 V下電泳約20 min，取出瓊脂糖膠塊并在紫外燈下顯影，膠塊上300 ～400 bp 為所需標準品的區間，切下該區間的瓊脂糖，通過膠回收得到標準品。采用紫外分光光度計檢測標準品濃度，標準品定量為6.02×1023（拷貝/mol）×質量濃度（g/ml）/（DNA 長度×660）。

1.5 改良的qPCR

根據VZV DNA 保守序列ORF59 設計出正向引物：5'-CGGTTGGGTTGTCTTCTGTG-3'，反向引物：5'-GCGACGAACCGTAAGCGTGG-3'，長度1 955 bp。改良的qPCR 反應體系：VZV DNA 樣品1μl（梯度稀釋的標準品及PBMC、血漿中提取的DNA）、正反向引物各0.3μl、MasterMix（SYBR Green 法）10μl 和ddH2O 8.4μl；反應條件：95℃預變性2 min，95℃變性1 min，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，共40 個循環。qPCR 檢測下限為15.5 拷貝/μl。熔解曲線：95℃變性1 min，55℃冷卻1 min，使DNA 雙鏈充分結合，最后從55℃逐步加熱至98℃，每一步增加0.5℃并保持10 s，同時采集熒光信號。

1.6 VZV DNA 試劑盒

采用Taqman 探針法qPCR，反應體系：混合液35.0μl、酶（Taq+UNG）0.4μl 和樣品4.0μl（梯度稀釋的標準品及PBMC、血漿中提取的DNA）。反應條件：94℃預變性2 min，93℃變性15 s，60℃退火60 s，共40 個循環。

1.7 統計學方法

數據分析采用SPSS 20.0 統計軟件。計數資料以率（%）表示，比較用Fisher 確切概率法，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 標準品分析

在3 次巢式PCR 反應中，分別加入標準品引物1、標準品引物2 和標準品引物3。在第1 次PCR 反應中利用皰液中的VZV DNA 作為模板，得到大小為489 bp 的產物1 ；在第2 次PCR 反應中以產物1作為模板，得到大小為404 bp 的產物2；在第3 次PCR 反應中以產物2 為模板，得到大小為395 bp的產物3，即標準品。以上產物在凝膠電泳實驗中均無雜帶出現（見圖1）。標準品經測序，并與VZV DNA 進行比對，發現兩者匹配程度高，且匹配片段相似性良好，標準品被匹配的堿基數占比為99%（見圖2）。故利用巢式PCR 制備的產物3 純度、特異性和穩定性均良好，可以用作qPCR 實驗的標準品。

圖1 3 次巢式PCR 擴增產物凝膠電泳結果

圖2 Blast 檢測標準品堿基與VZV DNA 堿基的配對

2.2 改良的qPCR 反應的標準曲線、擴增曲線及熔解曲線

以巢式PCR 制備的產物3 作為標準品，并梯度稀釋（1×100、1×101/2、1×101、1×102、1×103），然后采用改良的qPCR 進行檢測。其中標準曲線決定系數R2=0.9999，回歸方程Y=-3.9367X+45.07。見圖3～5。

圖3 改良的qPCR 反應的標準曲線

圖4 改良的qPCR 反應的擴增曲線

2.3 兩種VZV DNA 檢測方法比較

隨機抽取15例帶狀皰疹患者，分離出PBMC 標本，分別采用改良的qPCR 與VZV DNA 試劑盒檢測PBMC 中VZV DNA 陽性率。2 種方法的陽性率均為73.3%（11/15），經Fisher 確切概率法檢驗，差異無統計學意義（P=1.000）。2 種檢測方法效果相近。

2.4 2 種標本治療前后的VZV DNA 陽性率變化

隨機抽取22例帶狀皰疹患者，分離出PBMC 和血漿標本，采用改良的qPCR 檢測伐昔洛韋抗病毒治療前后VZV DNA 的陽性率。在治療前、治療后，PBMC 與血漿的VZV DNA 陽性率比較，經Fisher 確切概率法檢驗，差異均無統計學意義（P＞0.05），表明血漿可替代PBMC 進行VZV DNA 的檢測。PBMC、血漿標本治療前與治療后VZV DNA 陽性率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），表明伐昔洛韋抗病毒治療方案未降低VZV DNA 水平。見表1。

3 討論

VZV 屬于人類皰疹病毒3 型，其DNA 相對分子質量大小約為12 000 bp。目前普遍使用qPCR 進行VZV DNA 的定量檢測，qPCR 操作簡便，敏感性和特異性高，其標準品可為質粒和純化的DNA[10]。DWORKIN 等[11]在 進 行VZV DNA 的qPCR 檢 測 時，使用SYBR Green Ⅰ作為染料，選用VZV DNA 的保守區域ORF59 設計特異性引物，并采用純化的病原體作為標準品。本實驗中qPCR 所用的染料和引物均與之相同，但獨創之處在于筆者使用巢式PCR制備標準品，并通過凝膠電泳及基因序列比對，驗證了所得DNA片段的純度和特異性。而質粒作為標準品，制作工藝復雜且成本較高，所以本研究選取上述DNA 片段作為標準品[12]。另外，帶狀皰疹患者VZV DNA 檢測結果表明，PBMC 與血漿標本的陽性檢出率無差異，鑒于血漿的獲取更加便捷，所以臨床或許可以采用血漿代替PBMC。國外的研究表明，血液中大約39% VZV DNA 存在于血液細胞外成份中，這也是血漿能夠用于檢測VZV DNA 的理論依據之一[13]。

國外有研究表明，帶狀皰疹患者留取皮膚病變、PBMC 和血漿標本進行VZV 檢測，所有患者檢測陽性[14]。本研究從帶狀皰疹患者皮膚病變中獲得標準品進行qPCR，從PBMC 和血漿中檢測VZV DNA 效果良好，且抗病毒治療前后PBMC 和血漿標本中VZV DNZ的陽性檢出率未顯著下降，通過Taqman 探針法也得出了相同結果，這或許與抗病毒治療時間和隨訪時間較短有關[9]。筆者下一步研究將擴大樣本量、延長抗病毒治療時間和隨訪時間，以觀察VZV DNZ 的陽性檢出率變化。

目前臨床對于帶狀皰疹的抗病毒治療往往需要等到皰疹出現并確診帶狀皰疹后才開始進行，而皰疹的出現標志著帶狀皰疹病程已進入中后期，故難以實現抗病毒療效的最大化。最近研究表明，若帶狀皰疹患者出現發熱、疲勞不適等全身癥狀，則提示病毒血癥，結合血液病毒檢測陽性結果，即具備抗病毒治療指征[15]。帶狀皰疹合并病毒血癥，容易導致帶狀皰疹患者預后不良，且外周血VZV 病毒載量與帶狀皰疹后遺神經痛發生率呈正相關[16]。帶狀皰疹患者合并病毒血癥的早期抗病毒治療有助于縮短病變愈合時間；帶狀皰疹患者發病72 h 內實施抗病毒治療，能夠實現療效的最大化，顯著降低外周血VZV DNA 水平，并有助于緩解帶狀皰疹相關性疼痛[14]。

值得注意的是，帶狀皰疹患者唾液中VZV DNA的拷貝數和帶狀皰疹相關性疼痛亦存在關聯[13，17]。通過接觸帶狀皰疹患者的唾液及呼吸道分泌物，非免疫人群可感染VZV 并發生帶狀皰疹[18]，故帶狀皰疹患者咽拭子或唾液中VZV DNA 的分布情況和診斷價值，以及帶狀皰疹發病72 h 內抗病毒治療降低唾液等分泌物中VZV DNA 的效果等尚需要進一步研究。另外，對于患有水痘且合并病毒血癥的孕婦，VZV 可透過胎盤屏障并對胎兒的生長發育造成不良影響[19]。下一步筆者將研究帶狀皰疹孕婦患者合并病毒血癥對胎兒的影響，并探索咽拭子和唾液標本對帶狀皰疹的診斷價值等，以深入了解帶狀皰疹的致病性和傳染性。