土壤外源鈷對大麥根伸長的毒害及其預測模型

李金瓶，王學東*，馬虹，馬義兵

（1.首都師范大學資源環境與旅游學院，北京 100048；2.澳門科技大學澳門環境研究院，澳門 999078）

鈷（Co）是自然存在的元素，廣泛存在于巖石、土壤、水和植被中。Co的用途廣泛，被譽為戰略金屬，是生產高強度、耐高溫、耐腐蝕合金的重要原料，也是石油工業催化劑的重要來源[1-4]。Co能夠參與維生素B12的合成，對人體、動物、植物都有積極作用[5]。我國土壤背景值全Co含量為0.01～93.9 mg·kg-1，算術平均值和幾何平均值分別為 12.7 mg·kg-1和 11.7 mg·kg-1，約95%的土壤全Co含量范圍為4～31.2 mg·kg-1，北方土壤較南方高，且變化范圍小，大部分地區為12～35 mg·kg-1[6-7]。隨著社會發展，我國Co用量逐漸增加，從2004年的8 050～9 050 t上升為2016年的46 000 t[8]，Co的大量使用為環境帶來了潛在風險[9-10]。Co通過采礦冶煉、污水污泥以及肥料的使用等途徑進入土壤[11]，土壤中過量的Co能夠經遷移轉化過程進入植物和人體，抑制植物生長，并對人的健康造成極大的損害[12-13]。因此，土壤中Co風險評價及相關的基準閾值研究對Co污染防控至關重要。國外對Co生態風險研究起步較早，例如美國生態土壤篩選值（Eco-SSLs）中涵蓋了Co對植物、鳥類和哺乳動物的篩選值，分別為13、120、230 mg·kg-1，荷蘭土壤環境質量標準中Co離子干預值為240 mg·kg-1（土壤干質量）。但我國最新發布的《土壤環境質量農用地土壤污染風險管控標準（試行）》（GB 15618—2018）尚未涵蓋Co元素。

土壤性質是影響重金屬毒性和風險的重要因素，不同性質土壤通過吸附、沉淀、表面絡合等作用會對重金屬的生物有效性產生不同影響。據報道，Cu、Ni在我國不同性質土壤上對大麥的毒性閾值EC10分別相差了14.3、89.6倍，EC50相差16.9、52.5倍[14-15]。Micó等[16]針對歐洲北美土壤中Co的研究發現，10種不同性質土壤上（歐洲7種，北美3種）Co的大麥毒性閾值EC10相差了19.62倍，EC50相差了19.17倍。盡管我國在土壤Co的毒性評價方面也做了一些研究，但涉及的土壤類型較少[17-19]，尚不能建立有效的模型來評價和預測我國土壤中的Co風險。由于土壤性質的差異，歐盟建立的土壤風險評價模型并不適用于我國土壤[14-15]，因此，基于我國多種土壤類型開展土壤中Co毒性和風險評價工作，對制定我國土壤中Co的環境質量基準具有重要意義。

基于此，本研究選取全國范圍內具有一定代表性的11種不同性質的土壤，通過外源添加重金屬Co的毒性試驗，探究不同性質土壤中Co對大麥的毒性閾值，并量化土壤性質對Co毒性的影響，以期建立不同性質土壤中Co毒性的評價模型，從而為土壤中Co的生態風險評價及土壤基準制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品的采集和制備

采集我國吉林公主嶺、河北廊坊、海南?？诘鹊貐^的11種理化性質不同的農田土壤，土壤pH值范圍為4.93～8.86，有機碳（OC）為0.6%～4.28%，土壤黏粒（Clay）為 10%～66%，有效陽離子交換量（eCEC）為6.36～28.7 cmol·kg-1。采集的土壤樣品風干后過2 mm篩備用。

在正式試驗前，通過預試驗確定8個Co濃度梯度，Co濃度設置因pH不同而有一定的差別。當土壤pH＜7時，添加的外源Co濃度為0、50、100、200、400、800、1 600、3 200 mg·kg-1土；pH＞7時，添加的Co濃度為 0、100、200、400、800、1 600、3 200、6 400 mg·kg-1土。外源Co通過噴灑CoSO4·7H2O溶液的形式加入土壤中，保持100%持水量培養2 d[20]，風干后過2 mm篩備用。

1.2 土壤性質的測定

主要測定的土壤性質包括土壤pH、電導率、土壤總碳、無機碳、有機碳、土壤黏粒及其組成、鐵鋁錳氧化物、有效陽離子交換量等。參照Li等[14]的測試方法，在水土比為5∶1的條件下測量土壤pH和電導率[21]，有效陽離子交換量（eCEC）采用非緩沖的硫脲銀方法測定[22]，總碳使用高溫燃燒法測定，無機碳的含量使用Pressure-Calcimeter法測定[23-24]，有機碳含量為總碳與無機碳含量之差，通過沉降法測量土壤質地[25]，土壤中有效態鐵、鋁和錳的測定使用醋酸鹽溶液浸提。11種土壤的基本理化性質如表1所示。

1.3 毒性測試

植物根伸長抑制試驗參照ISO 11269-1-1993的標準方法。供試植物采用大麥（Hordeum vulgare L.），種子選取河南省農科院培育的駐大麥6號。取土樣120 g裝入高120 mm、直徑42 mm的圓柱形聚乙烯培養杯中。預先采用從杯底向上入水法測得每個土壤的田間持水量，試驗過程中用蒸餾水將土壤濕度調至測試土壤60%的田間持水量并培養7 d，每日稱量培養杯質量，保持整個試驗過程中土壤含水量恒定。將大麥種子用H2O2消毒，放置于帶有濾紙的培養皿中，用蒸餾水沒過種子靜置36 h，待胚根2 mm長，將大麥種子胚根向下種植在培養杯中，大麥種子離土表1 cm以下。每個培養杯種植6粒種子，放入培養箱培養。培養條件為白天 12～16 h（18～22 ℃），夜間 8～12 h（14～18℃），土壤濕度為65%～75%的田間持水量。為防止植物營養匱乏，加入濃度為0.429 g CO（NH2）2·kg-1土、0.263 g KH2PO4·kg-1土、0.420 g KCl·kg-1土的營養液，大麥生長4 d后取出，將大麥根系清洗干凈后置于坐標紙上讀取并記錄大麥根長，試驗設置3個重復。

表1 我國供試土壤的基本理化性質（n=11）Table 1 Basic physical and chemical properties of test soils in China（n=11）

1.4 數據統計和處理

外源Co對大麥根伸長的毒害效應采用邏輯斯蒂克分布模型（Log-logistic distribution）進行擬合[26]，方程如下：

式中：Y表示以未進行外源添加為對照組的大麥相對根伸長，%；X為lg（外源添加Co含量）。Y0、b、M為曲線擬合參數，M 為 lg EC10、lg EC50，EC10和 EC50分別為抑制大麥根伸長10%、50%時Co的濃度。通過這個方程可以獲得EC10、EC50以及95%的置信區間。

相關分析和回歸分析采用SPSS 21.0軟件，繪圖采用OriginPro 8.5軟件。

2 結果與分析

2.1 外源Co對大麥根伸長的劑量-效應曲線和毒性閾值

在11種供試土壤中，大麥相對根伸長和外源添加Co之間的關系用劑量-效應曲線（Log-logistic）擬合，擬合的曲線和毒性閾值EC10和EC50見圖1和表2。其中，湖南祁陽土壤中Co毒性閾值最小，EC10為37.1 mg·kg-1土，EC50為166.1 mg·kg-1土，陜西楊凌土壤中毒性閾值最大，EC10為 3 914 mg·kg-1土，EC50為 6 030 mg·kg-1土。EC10和 EC50極值分別變化了 105.5 倍和36.3倍，EC50受土壤性質的影響較EC10小。當在土壤中添加低劑量Co時，部分土壤中出現一定的刺激效應，略微增加了大麥根伸長，如重慶和張掖，其中最大增加量為對照組的113.84%，但影響不顯著，因此未使用低劑量毒物刺激效應（Hormesis）曲線進行擬合。

2.2 土壤性質與毒性閾值的Pearson相關性及其回歸模型

對土壤基本理化性質與大麥根伸長毒性閾值進行Pearson相關分析，結果如表3所示。土壤pH值與毒性閾值（EC10、EC50）具有顯著的相關性，達到了0.01的顯著水平，EC10與土壤黏粒（Clay）在0.1水平（雙側）上負相關，EC50與總碳（TC）在0.1水平（雙側）上正相關。

表2 土壤外源Co對大麥根伸長的毒性閾值（n=11）Table 2 Toxicity thresholds measured by barley roots elongation for added Co（n=11）

圖1 添加Co對大麥根伸長的劑量-效應曲線Figure 1 Dose-response curves of added Co concentrations for barley root elongation

表3 土壤性質與毒性閾值之間的Pearson相關系數Table 3 Pearson correlation coefficient between soil properties and toxicity thresholds

為進一步量化分析土壤性質對Co毒性閾值的影響，建立了土壤性質與Co毒性閾值之間的一元和多元回歸方程（表4）。從方程1和方程4可以看出，土壤pH是影響Co毒性閾值的關鍵因子，其單因子回歸方程分別解釋77.6%、72.0%的EC10和EC50的變異，土壤黏粒（Clay）可以解釋29.5%的EC10的變異（方程2），總碳（TC）可以解釋27.7%的EC50的變異（方程5）。如方程3和方程6所示，當引入雙因子時，回歸方程對毒性閾值的預測能力顯著提高。

表4 Co的毒性閾值和土壤性質之間的簡單和多元回歸方程Table 4 Simple and multiple linear regressions for Co toxicity thresholds and soil properties

2.3 模型驗證

將我國11種土壤性質代入擬合回歸方程進行內部驗證（圖2），大麥根伸長Co毒性閾值的測量值和預測值的誤差小于0.5個數量級。近年來，歐盟在建立重金屬的生態風險評價基準方面做了大量的研究工作，在10種（歐洲7種、北美3種）不同性質的土壤中添加7個Co濃度范圍（對照加6個Co劑量），以研究土壤性質與大麥根伸長毒性閾值的關系，研究土壤的pH 范圍為 4.30～7.53，有機碳含量（OC）為 0.8%～5.3%，土壤黏粒（Clay）為1.0%～47.9%，有效陽離子交換量（eCEC）為1.7～28.89 cmol·kg-1[16]。將基于我國土壤得到的預測模型和歐盟研究的土壤預測模型進行相互比較驗證。首先將歐洲、北美的土壤性質代入本研究得到的土壤預測模型（lg EC10=-0.302+0.4 pH；lg EC50=0.674+0.323 pH），得到對歐洲、北美土壤Co毒性閾值的預測值（圖3A），然后將本研究中我國11種土壤性質代入Micó等[16]研究中的回歸方程（lg EC10=0.95+0.94 lg eCEC；lg EC50=1.34+1.02 lg eCEC），得到歐洲、北美土壤預測模型對我國土壤Co毒性閾值的預測值（圖3B），結果表明，基于我國土壤得到的大麥毒性閾值預測模型可以較好地預測歐洲、北美土壤中Co的毒性閾值，如圖3A所示，EC50測量值和預測值的誤差均小于0.5個數量級，EC10測量值和預測值的誤差有50%小于0.5個數量級，50%位于0.5和1個數量級之間，但基于歐洲、北美土壤建立的預測模型不能準確預測我國土壤中Co的毒性閾值（圖3B）。這表明，基于我國土壤建立的Co預測模型具有更廣泛的適用性。

3 討論

圖2 大麥根長的ECx（x=10，50）測量值與預測值的關系Figure 2 The relationships between ECx（x=10，50）measured and predicted values for barley root elongation

圖3 大麥根長的ECx（x=10，50）測量值與預測值的關系Figure 3 The relationships between ECx（x=10，50）measured and predicted values for barley root elongation

不同性質土壤毒性測試中，Co對大麥根伸長的毒性閾值EC10的最大值是最小值的105.5倍，EC50的最大值是最小值的36.3倍，Micó等[16]在歐洲、北美土壤中對Co的研究結果表明，EC10、EC50最大值分別是最小值的19.62倍和19.18倍，揭示我國土壤中Co對大麥的毒性閾值變化范圍遠大于歐洲、北美。與利用我國土壤對Cu、Ni大麥毒性的研究[14-15]相比，Co的EC10變化范圍更大，EC50的變化介于Cu、Ni之間。這表明土壤性質對Co的大麥毒性閾值有很大的影響，建立基于我國土壤性質與Co毒性閾值之間的預測模型至關重要。本研究參照國際標準方法進行毒性測試，得到我國不同土壤中Co的大麥毒性數據，同時，基于土壤性質建立毒性閾值預測模型，在一定程度上可以減少大量試驗所耗費的人力、物力和財力，也為Co相關標準的制定和土壤中重金屬的環境風險評價提供一定的參考依據。

本研究發現土壤pH是不同性質的土壤中Co大麥毒性閾值的關鍵影響因子，隨著土壤pH值的增大，毒性閾值增大。蔡祖聰等[27]對57個不同性質的土壤樣品進行大樣本統計分析，結果顯示隨著土壤pH的增大，土壤中活性Co下降，這與本研究結果相似。據報道，土壤pH也是影響我國不同性質的土壤中Cu、Zn、Ni毒性閾值最為重要的因子[28-30]。這可能是因為當pH較低時，一些固相鹽類溶解度增加，從而導致對重金屬的吸附減少，同時隨著H+增多，H+競爭土壤吸附位點的能力增強，重金屬從土壤固相中解吸下來的量增加。另一方面，土壤pH對礦物和有機質表面的活性有一定的影響，隨著pH值下降，吸附界面的負電荷減少，降低了對重金屬的吸附能力[31-33]，從而影響了重金屬的毒性。

土壤pH值是本研究中大麥毒性閾值的主要影響因子，而歐洲、北美土壤中Co的大麥毒性閾值主要受有效陽離子交換量（eCEC）影響[16]，這和本研究不同。對比本試驗和歐洲、北美土壤的理化性質發現，歐洲、北美土壤的有效陽離子交換量（eCEC）變化范圍為1.7～28.9 cmol·kg-1（17倍），遠大于本試驗11種土壤的eCEC變化范圍（6.36～28.7 cmol·kg-1，4.51倍）。因為多個土壤性質具有自相關性，因此和閾值最相關的影響因素可能取決于性質變化較大的土壤性質。歐洲、北美10種土壤的理化性質[16]相關性分析結果表明，土壤有效陽離子交換量（eCEC）與pH、可交換鈣（Exch-Ca）、黏粒含量（Clay%）、砂粒含量（Sand%）和粉粒含量（Silt%）均有顯著的相關性（P＜0.05），這可能也是有效陽離子交換量eCEC能夠預測歐洲、北美不同性質土壤的毒性閾值的原因，同樣，我國11種土壤pH與黏粒含量（Clay%）、沙粒含量（Sand%）和鋁氧化物（Alox）也具有顯著的相關性（P＜0.05）。

為進一步建立適用范圍更廣的Co毒性預測模型，將基于我國11種土壤和歐洲、北美10種土壤[16]的所有毒性閾值和土壤性質進行Pearson相關分析，結果表明，毒性閾值與土壤pH和有效陽離子交換量（eCEC）均有顯著的相關性（P＜0.05），在此基礎上建立了普遍適用的回歸方程（lg EC10=0.057+0.326 pH+0.263 lg CEC，r2=0.863，P＜0.001；lg EC50=0.414+0.3 pH+0.344 lg CEC，r2=0.811，P＜0.001），基于此方程，我國11種土壤和歐洲、北美10種土壤的毒性閾值測量值和預測值如圖4所示，分別可以解釋本試驗土壤和歐洲、北美土壤82.4%和58.7%的EC10的變異，79.0%和74.7%的EC50的變異。較分別基于我國和歐洲、北美土壤得到的預測模型相比，該方程覆蓋的土壤性質范圍更廣，可為建立世界土壤范圍內的土壤Co風險評價模型提供參考。

4 結論與展望

（1）土壤性質對Co的大麥毒性閾值影響顯著，在選取的我國11種不同性質的農田土壤中，EC10、EC50最大值分別為最小值的105.5倍和36.3倍。

（2）土壤pH是影響不同性質土壤中Co毒性閾值的關鍵因子，基于土壤性質與大麥根伸長毒性閾值的回歸方程可較為準確地預測不同性質的土壤中Co對大麥的毒性，這為土壤中Co的生態風險評價和相關標準的制定提供了一定的參考依據。

（3）利用歐洲、北美土壤進行模型驗證，基于我國11種土壤建立的Co大麥毒性閾值預測模型可以較為準確地預測歐洲、北美土壤的毒性閾值。

本研究以外源添加重金屬試驗研究了Co對大麥的毒性，但在田間實際操作中，重金屬污染是一個長期過程，會發生老化作用，因此后續試驗還需進一步通過老化、淋洗等試驗矯正實驗室添加Co的毒性數據。另外，重金屬生態風險保護基準閾值還需要多個物種毒性試驗數據，然后利用物種敏感性分布等方法進行確定，因此接下來還需進一步試驗，取得Co對多個物種的毒性數據。

圖4 大麥根長的ECx（x=10，50）測量值與預測值的關系Figure 4 The relationships between ECx（x=10，50）measured and predicted values for barley root elongation