銅、鋅污染梯度對自然林地和農田土壤線蟲群落的影響*

李鈺飛，李吉進，許俊香，劉本生，喬玉輝，孫欽平?

（1. 北京市農林科學院植物營養與資源研究所，北京 100097；2. 北京市生物多樣性與有機農業重點實驗室，中國農業大學資源與環境學院，北京 100193）

生物多樣性與群落穩定性的關系一直以來是土壤生態學研究的熱點問題之一[1]。一般認為，食物網結構越復雜，生物多樣性越高，生態系統的穩定性越強。這是由于復雜的食物網中某一生物類群消失，可由相似功能的生物代替，從而可以保持生態系統的穩定[2]，相比之下簡單食物網某一食物鏈的斷裂則可能對生態系統功能產生較大影響。在陸地生態系統中，土壤樣品易于采集，土壤生物的提取和鑒別技術日益成熟，為研究生物多樣性和生態系統功能穩定性的關系提供了良好平臺。此前，已有不少學者開展了相關工作[3-6]，然而，大部分研究集中在地下生態系統分解者的層面上[1，7]，無法反映食物網的全貌，這樣的缺陷使得研究對象轉向能夠提供更為豐富的土壤生態功能信息的指示性生物[8]。

在眾多土壤生物中，線蟲的種類豐富，數量龐大，廣泛分布于地球上所有的土壤類型[9]，其占據碎屑食物網的多個營養級[10]，對土壤有機質的降解和養分循環起到重要作用[11]。依據世代周期和體型，線蟲可劃分成不同的生存對策者[12]，cp值為1的r對策者可對土壤有機物投入做出迅速響應；世代周期略長的一般機會主義者（general opportunists）通常具有更強的擾動耐受性；cp3-5的偏K對策線蟲則對干擾較為敏感，數量會減少甚至消失[12]。基于這些特性，線蟲群落結構可用于指示土壤環境狀況[13-14]，并由此發展出了一系列用于反映土壤食物網結構和功能的生態指數和評價工具[12，15-16]，廣泛應用于分析各類擾動對土壤環境的影響[17-19]。

重金屬污染是一類典型的土壤擾動，污染物通過大氣沉降、污水灌溉、固體廢棄物等途徑進入土壤，威脅土壤生物的生存繁衍，影響地下生態系統的正常運轉。單就線蟲而言，已有大量相關報道[20]，例如沿著污染梯度進行野外采樣，探討重金屬污染程度與線蟲群落的相關性[21-22]；或者定性或定量控制試驗，人為設置污染后觀察線蟲群落的變化[23-25]。Nagy[20]歸納具有明顯影響的重金屬元素包括Zn，Cu，Ni，Pb，Cr和Se。鑒于此，本試驗選取代表性元素Cu和Zn為擾動因子，探索兩種不同土壤中線蟲群落對重金屬污染的響應。所選樣地為臨近的同一土壤背景下的自然林地和農田，自然林地土壤具有更高的生物多樣性，視為健康土壤；而農田由于長期的擾動，食物網相對簡單，視為受脅迫土壤。有別于此前的報導[3，6]，本研究將從污染程度的角度出發，明確健康土壤和脅迫土壤對重金屬污染的抵抗力的差異，為后續從時間角度研究多樣性和穩定性關系提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

土壤樣品采集于北京市延慶區小豐營村（N40°26′0″，E115°53′2″），該區域屬溫帶與中溫帶、半干旱與半濕潤帶的過渡地帶，大陸性季風氣候，冬冷夏涼，年均氣溫8 ℃。多年平均降水量443.2 mm，降水時空分布不均。區域內土壤類型為潮褐土，質地為輕壤。取樣分別在臨近的自然林地和農田進行。自然林地面積約824 m2，為多年荒地植被自然演替而成，幾乎無人為干擾，其主要覆蓋植被包括豬毛菜（Salsola collina）、 刺兒菜（Cirsium arvensevar.integrifolium）、艾蒿（Artemisia argyi）、苣荬菜（Sonchus wightianus）和刺兒槐（Robinia pseudoacacia）。農田位于自然林地北側約43 m遠，面積約1 452 m2，種植西蘭花（Brassica oleracea）（取樣期間已收獲），并常年施用有機肥（25 t·hm-2）、復合肥（1.15 t·hm-2）和尿素（0.53 t·hm-2），人為擾動強烈。樣地土壤基礎理化性狀見表1。

表1 自然林地與農田土壤基礎理化性狀Table 1 Initial physico-chemical properties of wild woodland and farmland soils before the incubation experiment

1.2 土樣采集與試驗設計

土壤樣品采集時間為2017年6月21日。為盡量降低土壤異質性，每種樣地分別選擇地面均一的1 m2作為采樣樣方，用木鏟挖取0～20 cm土壤各20 kg，迅速帶回實驗室，常溫保存，并于三日內完成培養布置工作。

每種土壤分別添加CuSO4和ZnSO4作為重金屬擾動因子，根據參考文獻[26]的添加量以及我國土壤Cu和Zn三級污染的標準，設計對照（CK）、低濃度（L）、中等濃度（M）和高濃度（H）的添加梯度，分別為0、100、400、800 mg·kg-1干土的添加量，其中CK為兩種重金屬共用，因此試驗總計（1+3×2）×2=14個處理，重復3次。每盆裝入310 g過4 mm篩的鮮土，根據土壤含水率換算出干土所需的重金屬添加量。每盆自然林地和農田土壤分別加入80 mL和35 mL配置好的溶液，使得土壤達到田間持水量的60%。所有培養盆轉移至25 ℃培養箱中避光培養，每周補充水分一次，同時隨機調換位置；參考Liu[6]和Korthals[25]等的培養周期，于23 d后進行破壞性取樣。

土壤基礎理化性質的測定采用常規方法。土壤有效銅和有效鋅含量采用0.1 mol·L-1鹽酸浸提-原子吸收光譜法測定。Cu處理的土壤僅測定有效銅含量，Zn處理的土壤僅測定有效鋅含量，而兩種生境的對照處理有效銅和有效鋅均測定。

1.3 線蟲分離與鑒定

線蟲分離采用淺盤法。將60 g鮮土平鋪于1 mm網篩上，并在網篩上墊一層紙巾，48 h后收集淺盤中的線蟲，靜置1 d后保存于4%福爾馬林中。所獲線蟲于40倍倒置顯微鏡下進行計數，隨機挑選100條于100—400倍顯微鏡下根據線蟲頭部、尾部、食道等特征鑒定至屬水平。根據線蟲網站（http://nemaplex.ucdavis.edu/Ecology/EcologyMenu.htm）上的食性分類，所獲線蟲劃分為4個營養類群：食細菌線蟲（Ba）、食真菌線蟲（Fu）、植食性線蟲（He）和雜食捕食性線蟲（OP）。

1.4 數據處理

通過NINJA系統（http://sieriebriennikov.shinyapps.io/ninja/）將線蟲群落數據上傳，以計算用于指示食物網狀況和擾動程度的功能性生態指數，本試驗中用到的指標包括富集指數EI（Enrichment index）、結構指數SI（Structure index）和基礎指數BI（Basal index）。此外，還計算3個多樣性指標：香農指數H′（Shannon index）、優勢度指數λ（Dominance）和營養類群多樣性指數T（Trophic diversity）。H′=-∑pi（lnpi），λ=∑pi2，其中pi為第i個分類單元個體數在線蟲總數中的比例；T=1/∑pi2，pi為第i個營養類群在線蟲群落中的比例[27]。

重金屬擾動對線蟲的影響采用單因素方差分析，多重比較方法為LSD，對于不滿足齊次性檢測的數據，方差分析前進行ln（x+1），開平方或反正弦轉換，若轉換后仍不滿足齊次性要求，采取Kruskal-Wallis 非參數檢驗，并用 Mann-Whitney非參數檢驗兩兩比較處理間的差異。土壤之間，以及重金屬之間的對比采用t檢驗。所有分析顯著性水平設為P＜0.05，SPSS16.0中完成。

排序分析用來呈現不同處理間線蟲群落的差異，采用PCA模型，并將數據進行ln（x+1）轉化。分析在Canoco 5.0中完成。

2 結 果

2.1 不同處理土壤有效Cu和Zn含量

隨著添加量的升高，自然林地和農田土壤中有效態Cu或Zn均顯著升高（P＜0.05），有效銅最高值均出現在自然林地（363.79 mg·kg-1），有效Zn最高值出現在農田（297.27 mg·kg-1）（表2）。

表2 不同處理土壤有效Cu和Zn含量Table 2 Contents of soil available copper and zinc in the soil relative to treatment /（mg·kg-1）

2.2 Cu和Zn添加對線蟲數量的影響

重金屬施用梯度對線蟲總數有顯著影響，其中對自然林地的影響要強于農田土壤（圖1）。自然林地線蟲數量隨擾動增加而逐漸下降，并且在Zn的處理中更為明顯；而在農田則呈現低濃度條件下線蟲數量降低，中、高濃度下又升高的趨勢。在中、高濃度處理中農田線蟲總數高于自然林地，僅在Cu的中等濃度處理未見顯著差異（P＞0.05）；而在低濃度條件下，呈相反趨勢，并且在Zn處理中差異顯著（P＜0.05）。

自然林地中的植食性線蟲數量顯著高于農田土壤（P＜0.05）（圖1），且重金屬對自然林地植食性線蟲數量沒有顯著影響（P＞0.05），但對農田的表現出抑制趨勢。食細菌線蟲在各處理間的變化規律與線蟲總數的相近。重金屬對食真菌線蟲總體上無顯著影響（P＞0.05），僅在Zn處理的低濃度和高濃度之間表現出顯著差異（P＜0.05）。對于捕食雜食性線蟲，在自然林地僅添加高濃度Zn表現出顯著抑制效應（P＜0.05）；而在農田土壤，中、高濃度Cu，以及低濃度Zn均可顯著降低線蟲數量（P＜0.05）。

圖1 重金屬添加對土壤線蟲數量的影響Fig. 1 Effects of Cu and Zn addition on nematode abundance

2.3 Cu和Zn添加對線蟲群落結構的影響

試驗總計發現52個線蟲分類單位，其中自然林地48個，農田32個，其中自然林地特有的線蟲種類遠多于農田的（表3）。兩種生境均以食細菌線蟲為優勢類群；植物寄生類線蟲在自然林地為次優勢類群，但其在農田土壤中所占比例最小。在自然林地中，重金屬表現出抑制食細菌線蟲比例，提升植食性線蟲比例的規律；而在農田土壤則呈現相反的趨勢（表4）。

農田土壤中以Ba1線蟲和Ba2線蟲為主，且二者數量相當（表5）；自然林地中Ba2線蟲占絕對優勢，其次是Ba3線蟲，且這兩類線蟲在中、高擾動條件下大幅減少。He3是自然林地主要的植食性線蟲，其數量在高濃度擾動條件下有較明顯的下降。雜食捕食性線蟲以Om4為主，此外在自然林地中還存在相當比例的Pr5線蟲，其數量隨擾動程度的增加而減少。

表3 取樣期間所獲線蟲分類單位Table 3 Taxa of nematode identified in the soils under incubation

表4 不同處理各營養類群比例Table 4 Proportions of trophic groups relative to treatment/%

表5 不同處理各線蟲功能團數量Table 5 Number of functional groups of soil nematodes relative to treatment /（ind·100 g-1 dry soil）

續表

線蟲群落PCA分析顯示，自然林地各重金屬處理的線蟲群落與CK相似度較高（圖2a），僅在中濃度的Cu和Zn，以及高濃度的Zn表現出和對照較大的差異；相比而言，農田土壤CK與各重金屬處理后的線蟲群落差異更為明顯（圖2b），反映出添加重金屬對農田土壤線蟲影響更強烈。

圖2 線蟲群落PCA分析Fig. 2 Principal component analysis of nematode community

2.4 Cu和Zn添加對線蟲多樣性的影響

重金屬梯度對自然林地的優勢度和香農指數無顯著影響（P＞0.05）（圖3），但是顯著提升了中、高濃度處理的營養類群多樣性。對于農田土壤，添加重金屬表現出降低線蟲多樣性，提高優勢度的趨勢，Cu處理中在高濃度時達到顯著性差異（P＜0.05）；Zn處理中低濃度時即表現出顯著性差異（P＜0.05）。高濃度Cu添加顯著降低了農田土壤線蟲營養類群多樣性（P＜0.05）；而對于Zn組處理，低、中濃度表現出顯著的降低效應（P＜0.05）。無論是對照，還是添加重金屬后，自然林地線蟲多樣性（香農指數和營養類群多樣性）均高于農田土壤，且除低濃度的Zn處理外均達到顯著性差異（P＜0.05）。而優勢度指數呈現相反趨勢，但在對照、中濃度Cu處理中差異并不顯著（P＞0.05）。

2.5 Cu和Zn添加對線蟲功能性指數的影響

Cu對線蟲功能性指數的影響要弱于Zn的影響（圖4）。Cu僅顯著降低了農田土壤高濃度處理的結構指數（P＜0.05）。Zn添加對自然林地的富集指數無顯著影響（P＞0.05），但對基礎指數產生了先抑制，后提升的效應，并在高濃度條件下顯著降低了結構指數（P＜0.05）。Zn對農田土壤各線蟲功能性指數均有不同程度的影響，基礎指數和富集指數呈現出波動狀態，結構指數降低，并在中等添加濃度條件下呈顯著差異（P＜0.05）。總體上，重金屬添加梯度中自然林地線蟲的結構指數高于農田土壤的，并且在大部分對應的試驗組達到顯著性差異（P＜0.05），而富集指數呈現相反的趨勢，反映出自然林地食物網更為復雜，擾動較小，農田土壤呈養分富集狀態，擾動強烈（圖4）。基礎指數也表現為自然林地的高于農田的，但大部分對應組差異不顯著（P＞0.05）。

圖3 重金屬添加對線蟲多樣性的影響Fig. 3 Effects of Cu and Zn addition on nematode diversity

圖4 重金屬添加對線蟲功能性指數的影響Fig. 4 Effects of Cu and Zn addition on nematode functional indices

2.6 線蟲指標與有效態Cu和Zn的相關性

在添加Cu擾動處理中，自然林地的有效Cu含量同線蟲總數呈顯著負相關關系（P＜0.05）（表6），而同營養類群多樣性指數呈顯著正相關關系（P＜0.05）；農田中有效Cu含量同結構指數和香農指數呈極顯著負相關關系（P＜0.01），同線蟲優勢度呈顯著正相關關系（P＜0.05）。在添加Zn擾動的處理中，自然林地的有效Zn含量分別同結構指數和線蟲總數呈顯著（P＜0.05）和極顯著（P＜0.01）負相關關系；同營養類群多樣指數成極顯著正相關關系（P＜0.01）；農田的有效Zn含量同線蟲各指標均無顯著相關性。綜合了兩種生境（n=24）的各線蟲指標同有效Cu和Zn均無顯著相關性。

表6 線蟲指標與有效態Cu和Zn的相關性分析Table 6 Correlation analysis of nematode indices and soil available heavy metals

3 討 論

土壤線蟲是一類對環境污染和人為擾動反應敏銳的生物[12-13]，通常在重金屬濃度升高的土壤中，數量呈下降趨勢[25，28-29]，本研究中自然林地線蟲的數量的變化即符合這個規律。但是在農田土壤中，線蟲數量出現低濃度污染條件下降低，中、高濃度條件下又反彈的現象。由于食細菌線蟲在兩種土壤中均是優勢類群，因此線蟲總數的表現與食細菌線蟲密切相關。兩種土壤中食細菌線蟲群落結構本身存在明顯差異，自然林地中以Ba2線蟲為主，其次為Ba3線蟲，這兩類線蟲在中和高Zn和Cu脅迫條件下均不同程度的減少，也就導致了食細菌線蟲豐度的降低。而農田中世代周期較短、可以快速繁殖的Ba1線蟲平均占到48.5%的比例，Clarke和Shepherd[30]曾報道了一定濃度的Cu和Zn能刺激線蟲卵的孵化，增加線蟲豐度，因而本研究中農田土壤中線蟲數量的表現一定程度上與Cu或Zn的添加促進典型機會主義者繁殖有關。值得注意的是，農田中也有較高比例的Ba2線蟲，但其變化趨勢有別于自然林地的該類線蟲。即便屬于同一功能群，不同種類的線蟲對等同擾動的響應也可能存在差別[31]，從而影響兩種生境食細菌線蟲數量的變化趨勢。在自然林地中，植食性線蟲是次優勢營養類群，其數量未受Cu和Zn添加的影響。植食性線蟲豐富與其寄主密切相關，而自然林地植被覆蓋度較高，土壤中植物根及其碎屑豐富，短時間內不易分解。由此可以推測，對于自然林地土壤中植食性線蟲，食物資源相比Cu和Zn擾動是更為重要的影響因素。反觀在農田土壤中，植食性線蟲種類和數量本身稀少，且植物根系生物量小（根據地上植被情況推測，未實時測定），因而外源擾動因素的作用更為明顯。

雜食捕食性線蟲是線蟲中的高級類群，其在線蟲群落中的比例及由其發展出的結構指數常用來指示土壤食物網的復雜性[10，12]。在本研究中，自然林地相比農田土壤具有更為復雜的食物網結構，這點與Li等[27]報道的自然林地、農田和溫室等土地利用方式下線蟲群落特征的對比研究結果一致。值得注意的是，在施加同等條件的重金屬Cu和Zn擾動后，農田土壤的雜食捕食性線蟲數量相比自然林地受到的影響更為明顯，其在低、中等濃度擾動條件下即顯著降低，而自然林地土壤中，此類線蟲僅在經歷了高濃度脅迫才表現出顯著的減少，反映出從污染程度的角度出發，自然林地土壤食物網結構具有更強的抵抗力。然而，此現象與高cp值線蟲對擾動更為敏感[12]這個主流觀點看似并不完全相符。事實上，擾動并不一定對所有高級線蟲類群都造成負面影響，比如耕作和施肥擾動反而會促進Mylonchulus（Pr4）的 發 生[13]；Zhao 和 Neher[31]發 現Aporcelaimellus（Om5）和土壤Zn含量呈正相關趨勢；Liu等[6]對比了不同擾動條件下兩種土壤線蟲群落的響應，發現干燥脅迫提高了退化土壤的線蟲結構指數。本研究中雜食捕食性線蟲對Cu或Zn擾動可能存在不同的響應表現。

自然林地中線蟲的豐富度（分類單位數量）、香農指數和營養類群多樣性均高于農田土壤，而優勢度指數呈現相反趨勢。加入重金屬擾動后，自然林地線蟲香農指數依然能保持較高水平，而在農田土壤中多樣性顯著降低。在一個相似的研究中，Carrascosa等[3]報道了自然林地線蟲豐富度、食物網復雜性等指標在經歷農藥擾動后相比農田土壤表現出更強的抵抗力。盡管該研究是從時間的角度探索線蟲群落的變化，且施加的擾動有別于本研究，但也反映了低擾動、自然的、食物網復雜的土壤更有利于維持生物多樣性和群落穩定性[2]。自然林地的這種優勢可能與多種因素相關。首先，在自然的生態系統中，豐富的有機質可以對土壤動物及其功能起到保護作用[32]；此外，本研究中自然林地的土壤有效磷含量比農田低96.8%（表1），而Wakelin等[33]發現低磷環境有利于維持土壤功能的抵抗力；最后，根據生物多樣性保險假說[34]，自然林地的群落多樣性高，可能具備更多適應某種脅迫的互補型分類單位[35]。

相比線蟲數量和生態指標，PCA圖能更為直觀的反映出不同處理線蟲群落的變化。很顯然，在相同的擾動條件下，農田土壤線蟲群落的變化比自然林地明顯，這也與線蟲生態指數的結果一致。PCA分析還顯示在自然林地中，Zn擾動對線蟲群落的影響大于Cu的擾動，但與Korthals等[25]報道的等同Cu和Zn對線蟲群落的影響相似這個規律并不完全相符。

4 結 論

兩種生境的土壤在經歷Cu和Zn擾動后線蟲數量和群落結構表現出不同的響應趨勢。自然林地土壤線蟲數量隨Cu和Zn的添加濃度升高而降低；而農田土壤線蟲呈現低濃度擾動條件下降低，中、高濃度又反彈的現象。且相比自然林地，Zn和Cu擾動對農田土壤線蟲群落結構、多樣性和生態指數影響更為明顯。因而，從污染程度以及生物群落結構的角度來看，高多樣性的自然林地對Cu和Zn污染的抵抗力更強。未來將從時間的角度繼續探索線蟲群落的穩定性，為闡明土壤生物多樣性與穩定性關系提供佐證。