腸道菌群與腸道免疫相關研究進展

孫炘宸，趙晶晶，薛珊珊，吳擁軍*

(1.南京中醫藥大學，江蘇 南京 210029；2.南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇 南京 210029)

0 引言

腸道菌群是寄居在腸道內微生物群落的總稱，其種類豐富數量眾多，據統計定居于成年個體內的微生物約有1014個，是自身細胞數的10倍左右[1]。由于其具有消化、代謝、免疫等多種功能，被諸多學者稱為虛擬器官。早在上世紀六十年代，GF(Germ-free)級動物模型的建立使得人們發現了腸道菌群有促進腸相關淋巴組織(gut-associated lymphoid tissues，GALTs)發生及成熟的作用[2,3]。腸道作為體內最大的免疫器官，產生了全身近80%的抗體，大量研究表明腸道菌群失調與諸多疾病發病相關，而免疫系統則是重要的中間環節。探討腸道菌群和免疫系統的相互作用能解釋眾多生理和病理機制。近年來，腸道菌群與腸道免疫系統的研究取得了一定進展，現總結如下。

1 腸道菌群與腸道免疫系統發育的相關性

過去，學者多認為胎兒消化道處于無菌狀態，與外界接觸后微生物逐漸定植，至三個月左右逐漸形成一個較穩定的群體[4]。近來有研究表明這一過程可能源于出生之前[5,6]，胎兒的菌群組成與羊水群落相似[7]。菌群對腸道免疫系統發育的影響主要體現在形成合適的腸道環境與促進GALTs發生及成熟兩個方面。嬰兒出生后的幾小時內，大量需氧菌與兼性厭氧菌定植，影響腸道CD4+、CD8+T細胞的數量與活化狀態，改變了CD4亞群分布與腸道微結構，并與母乳中的免疫球蛋白共同幫助嬰兒適應外界復雜的抗原環境[8]。同時創造相對無氧的環境，為厭氧菌的定植做好鋪墊[9]。出生后的1-7天，大量厭氧菌定植，腸道菌群數量呈爆炸式增長，在菌群的影響下，單核細胞與巨噬細胞不斷發育直至成熟，中性粒細胞數目到達峰值[10]。腸道菌群在多個方面影響著免疫系統的發育：如嬰兒斷乳后，在缺乏外來分泌性免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A，SIgA)的情況下，大腸埃希菌、雙歧桿菌等促進B細胞的成熟與免疫球蛋白的分泌[11,12]；某些微生物信號促進了調節性T細胞(regulatory T cell，Treg)及自然殺傷T淋巴細胞的發育[13]；腸道菌群通過誘導淋巴組織誘導細胞(lymphoid tissue inducers，LTi)，協助派伊爾結(Peyer's Patch，PP)、孤立淋巴濾泡、闌尾及腸系膜淋巴結的形成[14]等。有學者推斷，腸道菌群對于GALTs的正常發育一定程度上依賴其病原相關模式分子(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)與相應的模式識別受體(pattern recognition receptor，PRRs)結合并激活下游的信號通路，但具體機制尚不明了[15]。

2 腸道菌群與腸道免疫細胞的相互作用

2.1 T淋巴細胞

多種腸道菌群均可刺激T淋巴細胞產生免疫應答，協助其增殖與分化，并促進各細胞亞群分泌不同的細胞因子。腸道菌群對T淋巴細胞的影響主要體現在Treg和輔助T細胞(T helper cells,Th)兩方面，如梭狀芽孢桿菌促進Treg的增殖分化[16]，分節絲狀菌促進Th17的增殖分化[17]。此外菌群代謝生成的短鏈脂肪酸(SCFAs)，也可以促進Treg的形成[18]。Treg的主要作用是維持免疫耐受，防止對腸道菌群的過度免疫。多種腸道菌群均可增加Foxp3在CD4+Treg和CD25+Treg中的表達、促進IL-10生成，抑制髓系細胞和Th17的異常活化，防止過度免疫[19]。大鼠腸道菌群缺失會導致體內RORγt+Treg細胞缺如。與菌群相關的Th亞群中以Th17的研究較多。研究表明，分節絲狀菌介導Th17的產生與分化是通過腸上皮細胞、ILC3和單核細胞等多種途徑互相作用實現的[20]。Th17主要功能是介導炎癥反應，分泌IL-17、IL-22等促炎癥因子[21]。Treg與Th17的功能相互制衡，二者的平衡對于維持腸道穩態意義重大，腸道菌群在其中起到了一定的作用。

2.2 B淋巴細胞

腸道菌群對B細胞免疫的影響主要體現在其分泌免疫球蛋白的過程中。早年即有研究表明，腸道菌群缺乏會導致PPs發育不成熟，外周SIgA、SIgM水平降低[3]。此后研究發現其與B淋巴細胞相關。目前對此的研究大部分聚焦在SIgA上。菌群通過兩種途徑影響B淋巴細胞分泌SIgA：(1)T細胞依賴型主要發生在PPs中，多由致病菌引發。M細胞提呈微生物抗原至樹突狀細胞(Dendritic cells,DCs)，后者促使T淋巴細胞分化為濾泡輔助性T細胞(follicular helper T cell, Tfh)亞群。Tfh通過表達CD40L和IL-21，誘導B細胞表達胞嘧啶核苷脫氨酶并促進IgA的抗體類別轉換，產生高親和力SIgA[22-24]。(2)非T細胞依賴型主要發生在固有層與孤立淋巴濾泡，腸道菌群多激活此途徑。DCs通過Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)感知菌群后產生B細胞激活因子與增殖誘導配體，誘導B細胞胞嘧啶核苷脫氨酶的表達，產生低親和力SIgA[22-24]。但機體如何識別不同細菌的機制仍未被發現。SIgA對菌群的影響表現在物理隔絕與調節免疫兩個方面：如隔絕微生物、保護免疫球蛋白、中和腸酶腸毒素；及激活局部免疫、抑制變態反應、形成免疫耐受等[25]。近年發現SIgA尚能直接調控細菌的基因表達[26]與影響菌群分布[27]。此外，亦有學者發現SIgM在致耐受的過程中也起到了重要的作用，其部分功能與SIgA相重合且其免疫效力要強于SIgA[28]。

2.3 DCs與巨噬細胞

二者均為髓系細胞。DCs是一種重要的抗原遞呈細胞，而巨噬細胞除了抗原遞呈作用外，還具有吞噬功能。過去，學者已經發現其表面的PRRs(主要是TLRs)能起到識別作用[29]。近年研究發現，DCs通過PRRs能夠識別腸道菌群中的微生物，激活MyD88和TRAM-TRIF信號通路[30]或通過上皮細胞NOD2蛋白激活NF-κB信號通路，分泌相關的細胞因子促進Treg的分化[31]。SCFAs則能夠上調DCs H3K4的三甲基化狀態，并誘導IL-6和IFN-β1的分泌從而激活自然殺傷(cNK)細胞[32]。腸道菌群還能通過影響CD103+DC，從而影響腸歸巢受體CCR9和整合素α4β7(α4β7-integrin)[33]。亦有研究發現，菌群通過DCs激發Mincle-Syk軸，幫助PPs中的細胞生成IL-17與IL-22[34]。

2.4 固有淋巴細胞(innate lymphoid cell,ILC)

ILC是呈現淋巴樣形態但無基因重排的抗原受體樣細胞[35]，分為ILC1、ILC2、ILC3三個亞群。其中cNK細胞、LTi細胞分屬ILC1與ILC3[36,37]。三類的功能分別與Th1、Th2、Th17有所類似[38]。其細胞毒與分泌細胞因子的功能需依賴于腸道菌群并受其調控[39]。菌群代謝物如視黃酸(RA)能夠幫助ILC1與ILC3從CCR7轉變為CCR9進而遷移至腸道[40]。但具體的作用機制尚存在爭論，是近來的研究熱點。近來研究發現ILC3具備呈遞菌群相關抗原的能力并能夠抑制相應T細胞的活性[41]。說明ILC3的功能除了通過分泌相關細胞因子直接影響菌群，也可以通過適應性免疫系統促使菌群形成免疫耐受。

2.5 潘氏細胞

潘氏細胞是消化道特有的免疫細胞，能通過TLRs-MyD88信號通路直接感受菌群刺激，釋放防御素[42,43]。潘氏細胞被刪除的小鼠不能控制腸道共生菌與致病菌的侵入，說明潘氏細胞對于控制腸道菌群穩態有著重要作用[44]。同時，腸道菌群通過表達去磷酸酶以去除細菌表面的負電荷，從而抵御防御素等陽離子抗菌類多肽的殺傷[45]，形成平衡。

3 腸道菌群對腸道屏障的作用

3.1 腸道菌群對腸道粘膜機械屏障的作用

腸道菌群與腸道上皮黏附形成生物性機械屏障。菌群通過競爭生存空間，占據結合位點來抑制致病菌，某些特定菌群還能產生細菌素等直接抑制或殺滅致病菌[46]。例如乳酸桿菌可通過分泌抗菌物質、調節腸道pH等途徑抑制某些病原菌的定植[47]。腸道上皮表面亦有PRRs存在，當普通小鼠腸上皮受到損傷時，腸道菌群能夠快速識別TLRs，阻止腸上皮細胞受損并促進其分化增殖，其速率遠高于無菌小鼠[3,48]。菌群通過TLR2信號途徑能夠加固腸上皮連接，改變其通透性從而加強屏障功能[49]。此外，菌群還可根據腸道位置影響腸上皮細胞miRNA的表達[50]。

3.2 腸道菌群對腸道粘膜免疫屏障的作用

腸上皮細胞表面覆蓋著由杯狀細胞產生的黏液，這些黏液形成保護屏障，隔絕大部分細菌與腸道上皮的直接接觸[51]。不同部位黏液層的組成有一定差異，但其主要成分均為黏蛋白與抗菌物質[52]。菌群通過PAMPs促進黏液分泌[53]。無菌小鼠[54]與抗生素暴露小鼠[55]腸道的杯狀細胞數量明顯減少，并且黏液層缺乏重要免疫分子，表明腸道菌群對黏液層的形成具有重要作用。腸道菌群代謝產生的SCFAs在低濃度下對黏液的分泌與黏蛋白MUCs2的表達起促進作用，在高濃度下起抑制作用[56]。

除了黏液的分泌外，腸上皮細胞在持續與微生物或其產物接觸后，也能直接產生多種抗菌肽[57]。菌群與上皮的黏附作用能夠刺激上皮細胞產生TNF-α，并激活腸上皮的TLRs和NODs[58]；同時誘導腸上皮細胞上調血清淀粉樣蛋白A的合成，激活固有層的DC細胞[59]。SCFAs刺激腸上皮細胞以GPR41和GPR43依賴性方式，激活ERK1/2和p38MAPK信號通路，從而產生炎性因子和趨化因子[60]。

4 中藥干預對于腸道菌群及免疫功能的影響

以往大量研究都已證明中藥有調控腸道菌群的功能，口服的中藥制劑能直接與腸道菌群接觸并發揮所用。近來研究進一步深入，發現除了直接作用外，中藥還能夠通過影響免疫系統間接調控菌群，從不同層面共同起到調節腸道菌群結構、阻止腸道菌群移位、改善腸道菌群功能的作用[61,62]。鄭彥懿等[63]發現大黃牡丹湯通過抑制腸道菌群SCFAs的分泌調整腸道菌群平衡。孫必強等[64-66]發現七味白術散能迅速增加小鼠腸道中特定菌群菌量、改善腸組織微結構并影響SIgA、TNF和IL含量。吳佳偉[67]證實大黃酸通過改變小鼠腸道菌群結構、降低腸道內尿酸水平、提高SCFAs的產生來保護腸道黏膜屏障。劉錦等[68]證實大黃附子湯加味可調節膿毒癥胃腸功能障礙的腸道菌群與腸道免疫異常，發揮治療膿毒癥的作用。除了局部疾病，許多研究也證實了中藥具有通過腸道菌群影響免疫系統進而治療其他系統疾病的功能，如以鱉甲煎丸治療非酒精性脂肪肝[69]、理肺湯干預慢阻肺[70]等。同時中藥的作用也與腸道菌群密不可分，目前已經發現腸道菌群能促進許多中藥成分如黃芩苷等的代謝與吸收[71]。

5 總結

腸道菌群與腸道免疫之間的作用機制的在近年取得了一定的進展，為諸多疾病，尤其是免疫性疾病的發病機制填補了一些空白，并為治療提供了新的思路。對腸道菌群與免疫的研究，也為研究中醫藥提供了新的落腳點與思路。目前研究中藥復方被廣泛采用的血清藥理學，即是日本學者在研究腸道菌群的過程中提出的，以黑箱理論的形式避開復雜的內部成分，直接研究藥物的總體效應，證明了中醫藥的有效性[72]。此外，隨著腦腸軸、肝腸軸、肺腸軸、黏膜共同免疫等概念的提出，對于機體各系統之間聯系研究的深入，很多現有結論與中醫的傳統理論相呼應。一方面從微觀角度解釋了經典理論的內在機理。另一方面提示我們是否能繼續從一些經過臨床驗證的經典理論入手，指導科研的探索，做到推陳出新。

盡管目前在各個方面已經取得了很多成果，仍有一些問題亟須解決：(1)16SrRNA基因測序受制于從樣本中獲得的DNA及其PCR效果，考慮到腸道菌群群落的繁雜，當下對于腸道菌群的認識仍十分有限；(2)大部分研究成果來自于實驗動物，不同物種間的腸道菌群具有差異，其機制是否與人體一致仍需進一步證實；(3)中藥目前仍是以復方作為主要的治療手段，血清藥理學雖然證明了其有效性與整體的作用機制，對于黑箱中具體機理的研究仍不夠深入。但隨著相關學科的進步與實驗方法的改進，相信這些問題能得到妥善解決。屆時，分析菌群對協助疾病的診斷治療與推進中醫藥現代化將具有重大意義。