糖尿病腎病早期診斷的尿標志物研究進展

李博偉，郝健通信作者)

(1.內蒙古醫科大學第一臨床醫學院，內蒙古 呼和浩特 010050；2.內蒙古醫科大學附屬醫院腎內科，內蒙古 呼和浩特 010050)

0 引言

2019年國際糖尿病聯盟(International Diabetes Federation，IDF)公布了全世界糖尿病患病率的數據[1]，意外的是這些最新的統計數據顯示，糖尿病的患病率已達到9.3%(4.63億人)。據估計，到2045年將增加到10.9%(約7億人)，這些預測并不樂觀。而糖尿病腎病(diabetic kidney disease，DKD)的發生率隨著糖尿病患病率的增長而快速上升，據統計，約40%的糖尿病患者會發生腎臟損傷，DKD將可能成為ESRD的主要病因[2]。因此，迫切需要診斷標志物來進行早期診斷及評估腎損害的程度。尿液是檢測腎損害的理想來源，尿液由腎臟產生，在一定程度上可以反映腎臟損傷，而且尿液收集簡單，對患者的身體沒有傷害，尿標志物對腎損害的程度評價也更為準確。本文探討了研究較多的幾種尿標志物的研究進展。

1 臨床常用診斷標記物的限制

DKD的診斷依據應具備以下至少1條[3]：(1)高血糖為CKD 的起始病因，或能確定高血糖與CKD之間的因果關系，或者排除了非糖尿病性腎臟疾病。(2)已有病理學診斷的支持。對腎臟的損傷程度是基于GFR和尿白蛋白的分期來進行評估。白蛋白尿及腎小球濾過率是目前臨床上診斷DKD最常用的檢驗指標。

1.1 尿白蛋白

在目前的臨床診療中，檢測尿液中蛋白含量，是診斷腎臟功能損害的一項重要及常用指標，檢測方法主要有尿白蛋白排泄率(urinary albumin excretion rate，AER)、尿白蛋白/肌酐及尿蛋白定量。在DKD的早期，AER的升高遠早于尿總蛋白的升高，有一些正常蛋白尿的患者就已經出現腎功能不全[4]，正常白蛋白尿的患者可發展成微量、大量蛋白尿，但不是所有蛋白尿患者都能發展成ESRD，檢測微量白蛋白尿對于腎功能出現的微小變化也不是太敏感[5]。尿白蛋白/肌酐容易受到其他因素的影響，如泌尿系統的感染、肌肉量的大小、人體生理波動以及標本的儲存不當等[3]。24h尿蛋白定量是臨床上用于評估腎臟損傷的常用檢驗，但很少用于診斷早期腎損害，其需留存24h的尿液總量，由于留存時間過程較長，可能會受到外界環境的污染、時間不準確及病人依存性較差等問題，因此需要更敏感、更準確的標志物來檢測早期腎損傷。

1.2 腎小球濾過率(Glomerular Filtration Rate，GFR)

GFR是衡量腎排泄功能的重要指標，在DKD的早期沒有腎病的表現，僅有血流動力學的改變，表現為高濾過，即GFR升高，隨時DKD的進展，GFR出現下降。目前有多個用于估算的腎小球濾過率(estimated GFR，eGFR)公式，都是基于血肌酐或者胱抑素C進行計算，而血肌酐檢測早期腎損傷的敏感性較差[6]，且容易受到其他因素的影響。菊粉清除率被認為是測定GFR的金標準，但是其操作較為繁瑣，目前臨床開展困難。根據GFR對CKD進行分期，可了解腎臟疾病所處階段，但不能完全準確的反應腎臟損傷的早期階段。

2 新型的早期診斷標志物

2.1 單核趨化蛋白1(Monocyte Chemoattractant Protein 1，MCP-1)

先前的研究表示DKD是一種慢性、低水平的炎癥性疾病，在DKD中可以檢測到炎癥細胞的浸潤及炎性因子的表達，炎癥反應的重要步驟是白細胞向受損組織的發生集聚反應，而趨化因子能誘導這一現象的發生。MCP-1屬于趨化家族中CC家族的一種，對單核細胞具有強大的趨化作用。MCP-1可在多種細胞中表達，如單核細胞、巨噬細胞及肥大細胞等，在腎臟中，產生MCP-1的細胞類型有血管內皮細胞、小管上皮細胞、系膜細胞、足細胞以及浸潤性細胞。MCP-1的首要功能是調節炎性細胞(單核-巨噬細胞)的運輸，控制炎癥的發生發展，調控腎組織損傷中白細胞的聚集，刺激系膜細胞合成纖維連接蛋白等[7]，高血糖可通過氧化應激誘導MCP-1的產生，促進晚期糖基化終產物(AGE)的生成和NFkb的活化[8]。越來越多的研究確定了血液及尿液中MCP-1的表達與DKD發生發展的相關性。Chow等證明了在鏈脲佐菌素(STZ)誘導的小鼠糖尿病腎病中，MCP-1缺失可減少巨噬細胞對腎小球和間質的浸潤，減輕腎組織損傷[9,10]。也有研究表明尿MCP-1與基線蛋白尿和腎功能之間存在相關性[11,12]，尿MCP-1水平與腎小球及腎小管間質病變的嚴重程度保持相關，高水平的尿MCP-1是DKD患者GFR快速丟失的預測因子[12]，尿MCP-1隨著腎臟損傷的嚴重程度增加，還與糖化血紅蛋白、炎癥標志物有顯著相關[13]，MCP-1可作為評估DKD進展程度的標志。

2.2 腎病蛋白(Nephrin)

Nephrin是免疫球蛋白樣家族的一種跨膜粘附蛋白[14]，在腎小球足細胞之間連接部分表達，是足細胞的組成部分之一，nephrin能夠將足細胞裂孔膜固定在肌紅蛋白細胞骨架上，對濾過屏障也起著重要作用。最初研究學者們認為nephrin只在腎臟中表達，隨后在胰腺、大腦及淋巴組織中也發現了nephrin的存在。高糖是導致足細胞損傷的唯一重要因素[15]，目前蛋白尿是用于評估腎損傷的臨床常用檢測方法，最近的研究表明nephrin的異常可能在蛋白尿之前就有發生。Rakesh[16]等在誘導 nephrin基因缺失小鼠模型中研究表明，通過增加nephrin表達或抑制其降解對腎小球的濾過功能是有幫助的。在鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病小鼠中，Kim[17]等觀察到腎小球中nephrin mRNA及蛋白質的表達隨腎小球的大小而變化，在肥大的腎小球中表達降低，而在相對較小的腎小球中表達增加。在之后的研究中，Alter[18]等人也證實了類似的實驗結果，使用STZ誘導的糖尿病小鼠模型為實驗組，而對照組接受無STZ的檸檬酸鹽緩沖液，18周后發現，盡管兩組之間的腎功能和尿白蛋白水平沒有顯著差異，但實驗組中nephrin的尿排泄量明顯更高，甚至在蛋白尿之前就出現了，由此得出尿液中nephrin的測定提供了早期發現糖尿病腎病的可能[18]。國外有項研究顯示[19]，在沒有明顯腎組織學病變的糖尿病患者和微量白蛋白尿患者中，腎組織活檢中nephrin的表達展現出明顯的減少和重新分布，并且隨著腎臟受累的嚴重程度出現進一步下降，這項研究結果表明，nephrin的表達下降和重新分布可能先于腎小球病變的發展，并且是糖尿病腎病發展的早期事件[19]。另外一項實驗中[20]，研究人員使用mRNA RT-PCR方法測量了15名健康對照受試者、19名糖尿病前期和67名糖尿病受試者的尿nephrin，67名糖尿病受試者根據尿蛋白排泄率(UAE)分為正常(NO)、微量 (MI)和大量蛋白尿(MA)3組，結果顯示，糖尿病受試者的nephrin mRNA顯著高于非糖尿病受試者，MA中更高，分別在53%，71%和90%的NO，MI和MA受試者中發現尿中nephrin高表達(P=0.023)[20]。與非糖尿病受試者(甚至是NO患者)相比，糖尿病受試者的nephrin的尿mRNA水平升高，并且可以區分糖尿病腎病的不同階段，預測蛋白尿的發生[20]。這些研究都證明了nephrin可用于糖尿病腎病的早期診斷，而且在疾病的進展過程中也發揮作用。

2.3 腎損傷分子(Kidney injury molecule 1，KIM-1)

KIM-1是近期發現的一種I型跨膜糖蛋白，研究發現在間質性腎小管損傷中起重要作用，在正常腎臟中檢測不到，而在缺血性、中毒性等損害性腎臟疾病中顯示出明顯升高，廣泛表達于近端腎小管細胞的頂膜中，可作為進行性小管損害的生物標志物[21]。尿KIM-1在腎小管損傷后迅速增加，其水平與腎小管損傷的程度，間質纖維化和腎臟炎癥有關[22]。在一項研究中[23]，研究人員招募了80名eGFR＞60mL/min/1.73m2，尿白蛋白/肌酐＜300mg/g的2型糖尿病患者，通過評估腎臟損害的實驗室指標，發現正常蛋白尿至輕度蛋白尿患者中尿KIM-1差異顯著，且KIM-1能預測蛋白尿的發生，推測可能有助于2型糖尿病患者腎臟疾病的早期評估[23]。另外一項研究中[24]，根據尿白蛋白/肌酐(uACR)將招募的2型糖尿病患者分為正常、微量、大量蛋白尿三組，實驗結果顯示尿KIM-1水平與uACR相關(r=0.400，P＜0.001)，因此表明尿液中KIM-1水平可能是DKD患者的早期標志物[24]。Carvalh[25]等人的實驗結果也證實了尿KIM-1在DKD早期就出現了升高，提示腎小管早期就可能開始發生損傷[25]。Khalid[26]等人為了確定不同程度腎損傷的糖尿病患者體內KIM-1的水平，排除了其他腎臟疾病患者，根據糖尿病腎病的嚴重程度，將185名患者分為三組，實驗結果發現隨著腎臟受累的嚴重程度，尿KIM-1/肌酐的水平增加，尿KIM-1/肌酐也會隨著蛋白尿和eGFR的升高而升高，尿KIM-1可根據尿蛋白來評估DKD進展[26]。在一項動物研究中，Venkata[27]等人構建缺血性腎損傷的小鼠模型，發現隨著缺血的時間延長，腎小管細胞中KIM-1蛋白表達增加，尿液KIM-1水平也顯著升高，在構建慢性腎損傷鼠模型中也發現類似結果[27]，推斷KIM-1對檢測腎損傷有著高敏感性。后又從動物模型延伸到人類研究中[27]，招募了124名1型糖尿病患者進行長達5-15年的隨訪，其中有24名患者發展為ESRD，基線KIM-1水平與eGFR下降密切相關，也是進展為ESRD風險的預測標志，反映了腎臟隨著時間推移而受到的損害程度[27]。越來越多研究都證實了KIM-1作為腎臟損傷標志物的實用性，可反映糖尿病腎臟損害的進程，有望作為腎小管間質損傷的早期特異性、敏感性診斷標志物。

2.4 中性粒細胞明膠酶相關的脂蛋白(Neutrophil Gelatinase-associated Lipocalin，NGAL)

NGAL最初是在嗜中性粒細胞中發現的，屬于脂鈣蛋白超家族的成員蛋白，隨后發現腎小管細胞及其他類型的上皮細胞在受到損傷時可有異常表達，NGAL的分子量為25kDa，是很容易排泄到尿液中的一種小蛋白。近年來發現NGAL具有保護腎臟的作用，在腎功能衰竭時大量又迅速的產生，還能誘導胚胎腎臟中成熟腎單位的形成[28]。在先前的大量研究中已經證明NGAL是急性腎損傷(AKI)的早期敏感預測因子之一，可以作為腎小管間質損傷的早期標志物[29]。在1型糖尿病患者里，也有研究證明尿NGAL水平在微量蛋白尿時已經升高，表明腎小管損傷可能較腎小球損傷發生的早[30]。Wu等[31]人的研究中，招募63名非糖尿病患者作為對照組，201名2型糖尿病患者作為實驗組，結果發現實驗組中尿NGAL的水平顯著升高，并且與蛋白尿的嚴重程度相關，又對實驗組中正常及微量蛋白尿患者進行28個月隨訪，觀察到尿NGAL的水平升高預示eGFR的下降，因此得出結論，NGAL在DKD的發病中起著重要作用[31]。在Zylka[23]等人的研究中也證實了尿NGAL與蛋白尿成正相關，蛋白尿中度升高的患者與正常至輕度升高的患者相比，NGAL差異顯著，認為其可能有助于DKD的早期評估[23]。Vijay[32]等人發現2型糖尿病微量蛋白尿患者比無蛋白尿患者及健康對照者的尿NGAL水平顯著升高，并且與uACR呈正相關[32]，同樣另外一項研究中[33]，招募的2型糖尿病患者根據uACR分為正常、微量、大量白蛋白尿三組，發現大量蛋白尿組尿NGAL顯著高于其他組，與uACR相關，通過多元線性回歸分析顯示尿NAGL在早期DKD的診斷中敏感性最高，由此可以認為NGAL能用于檢測糖尿病患者的早期腎損害[33]。Li[34]等人測定了2型糖尿病患者中，正常白蛋白尿且腎功能不全(eGFR＜60mL/min/1.73m2)的患者尿NGAL的水平，與eGFR≥60mL/min/1.73m 2的患者相比，尿NAGL水平顯著升高，與eGFR呈負相關，因此得出結論尿NGAL可作為2型糖尿病患者中正常白蛋白尿伴腎功能不全的潛在生物標志物[34]。Kapoula等[35]人關于NGAL預測早期DKD準確性的一篇文章中，采用meta分析方法，納入條件是利用uACR為分組標準將DKD根據嚴重程度分為正常、微量及大量蛋白尿組，有22項臨床研究符合，也都得出結論NGAL是預測1型和2型糖尿病患者早期腎損傷的一個有意義的生物標志物[35]。以上大量的研究都證明了NGAL對早期DKD的診斷價值。

隨著生活質量的升高，慢性疾病的發生也在日益增長，其中DKD患者不在少數，對于家庭及社會而言，負擔及壓力也越來越重。DKD是大多數有長期病史的糖尿病患者中常見的并發癥之一，屬于不可逆疾病，也是心血管疾病的獨立危險因素，早發現才能早治療，早期診斷為疾病治療中的重中之重。在目前的臨床工作中，微量蛋白尿的檢測是評估糖尿病腎損害最常用的指標，其標本易收取，且無創，但敏感性較低，容易受到各種因素影響。因此，尋找具有更高敏感性及特異性的早期標志物尤為重要，新興發展的基因組學及蛋白組學等為早期診斷提供了一些新思路，有一些研究也證明了尿液中存在潛在的生物標志物可用于DKD的早期診斷，但還需要更多更進一步的大型、多中心前瞻性研究來證實其臨床應用價值，期盼早日應用于臨床工作中。