苦參堿誘導腫瘤細胞凋亡的研究進展

劉悅

(陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046）

關鍵字：周期阻滯；凋亡通路；內質網應激；端粒酶

0 引言

細胞凋亡是在一些生理或者輕微病理因素刺激下，活體組織中的單個細胞主動死亡的過程。表現為細胞固縮，染色質邊集，細胞膜可出芽形成凋亡小體，凋亡小體被吞噬細胞或其他細胞吞噬[1]。現在研究表明，惡性腫瘤的產生與凋亡異常密切相關，一旦細胞周期監控失控，DNA受損的細胞將不能正常修復和凋亡，將繼續分裂，結果基因突變數量增加，往往導致細胞發生癌變[2]。目前很多化療藥物都是通過誘導凋亡抗腫瘤的，如依賴P53，Fas/FasL,Bcl-2介導的細胞凋亡[3]。苦參堿是中藥苦參的提取物，屬于生物堿類，近年來作為抗腫瘤藥受到廣泛關注，對肝癌，肺癌，乳腺癌等惡性腫瘤都有一定的抑制作用，主要通過誘導細胞凋亡發揮作用的。BH3-only蛋白模擬物，Bcl-2拮抗劑，bax激活劑這些合成的單靶點藥物，雖然能明顯調控某個蛋白表達，但是臨床試驗卻效果不佳，提示細胞有自身代償。而中國特有的中醫藥或者它的單體是多靶點的，多方面的，或許可以更好的應用于臨床。苦參堿可以通過誘導周期阻滯，調控信號通路，抑制端粒酶促進凋亡，還可以通過調控免疫反應，抑制腫瘤遷徙和轉移，抑制腫瘤血管生成發揮作用。

1 周期阻滯與細胞凋亡

細胞周期會受到嚴密的調控來保障細胞正常的分裂增殖，p53/p21信號通路是細胞核心調控途徑，p53調控p21表達，P21通過結合抑制CDK2（細胞周期素依賴性激酶）/CyclinE(細胞周期蛋白)和CDK4/CyclinD復合物,阻斷RB(視網膜母細胞瘤相關基因)基因磷酸化，去磷酸化的RB與E2F結合，使E2F無法調控下游基因表達[4]，細胞G1期阻滯。P53也可以誘導G2期阻滯，但不是必需的。細胞周期阻滯會使細胞修復，修復失敗就會導致細胞凋亡。很多惡性腫瘤都會出現P53突變，恢復P53的活性，成為腫瘤治療的熱門之一。馬建秀等[5]通過研究苦參堿聯合奧利沙鉑對結腸癌SW620作用時發現苦參堿可以誘導細胞凋亡，使細胞阻滯于G2/M期，而且具有增強奧利沙鉑誘導P53表達增加的作用。李磊等[6]通過研究氧化苦參堿對胃癌SGC-7901作用時發現氧化苦參堿可以使細胞P21表達增加，隨著時間越長，P21表達越明顯。而且氧化苦參堿可以使細胞阻滯于G0/G1期，隨著藥物濃度增加對G0/G1阻滯作用更強。肖旭等[7]在研究苦參堿對乳腺癌Bcap-37作用時發現苦參堿可以上調P53下調CyclinD1,C-myc蛋白表達，CyclinD1是P53下游基因，CyclinD1和C-myc主要調控G1/S期，說明苦參堿通過下調CyclinD1,C-myc蛋白影響G1期向S期轉換。耿婭等[8]發現低濃度苦參堿誘導肝細胞L-02阻滯G0/G1期，而高濃度苦參堿使細胞G2/M期阻滯，S期延長。苦參堿對細胞周期的調控，主要通過一些關鍵蛋白實現的，這些蛋白既可以作用于下游的周期蛋白影響細胞周期轉換，從而誘導周期阻滯，又可以作用于凋亡通路蛋白，使細胞發生凋亡。苦參堿把腫瘤細胞阻滯于哪一期，跟腫瘤細胞的類別和苦參堿的濃度有關。

2 凋亡通路與凋亡

凋亡通路分為內源性線粒體通路，死亡受體通路和內源性內質網應激通路，其中線粒體通路是中心調控階段。Bcl-2家族凋亡中抑制凋亡的蛋白如Bcl-2，Bcl-xl，Bcl-W等，促進凋亡的蛋白如Bax，Bak，BH3-only蛋白(Bid,Bad,Bim)也屬于促凋亡蛋白[9]。

2.1 線粒體凋亡通路與凋亡

線粒體凋亡通路是細胞凋亡最經典的途徑，在內源性損傷因素（如藥物干擾下，激素缺乏），BH3-only蛋白激活增多，使bax變構定位于MOM(線粒體外膜)上，BH3-only蛋白不以這樣方式作用于bak，因為bak直接定位于MOM上，BH3-only蛋白也可以使定位在MOM上的bax/bak暴露出BH3位點，形成bax/bak二聚體，寡聚體[10]，孔道開放，線粒體膜間隙中的Cytc進入胞漿與Apaf-1（凋亡蛋白酶活化因子），Pro-caspase-9，ATP結合，形成凋亡復合體，自我剪切激活Pro-caspase-9形成caspase-9，caspase-9剪切激活下游caspase-3，激活的caspase-3激活下游蛋白，誘導細胞凋亡[11]。

人類許多腫瘤都存在抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的過度表達，使腫瘤細胞生長加速，不易凋亡，最后惡性程度增加。抗凋亡蛋白可以使bax從MOM轉移到細胞質中，避免bax在MOM寡聚，有人認為是Bcl-xL通過Bax的持續轉移維持細胞質中的Bax[12]。抗凋亡蛋白增多還可以與促凋亡蛋白如形成Bax/Bcl-2異源二聚體，抑制bak/bax同源二聚體形成來抑制凋亡。抗凋亡蛋白增多可能與BH3-only蛋白結合，阻止BH3-only蛋白對bax/bak的激活[13]BH3-only蛋白模擬物作為新型抗腫瘤藥物，與腫瘤細胞過表達的Bcl-2蛋白結合，來阻止Bcl-2蛋白與bax/bak結合，促進腫瘤細胞凋亡。既往研究表明，苦參堿可以通過調節凋亡蛋白來誘導腫瘤細胞凋亡。劉桐等[14]在研究苦參堿對人結腸癌HT-29細胞凋亡作用時發現苦參堿可以使細胞Bax表達升高，Bcl-2表達降低。程向東等[15]在研究苦參堿對肝癌Hep G2細胞凋亡作用中發現苦參堿可以降低Bcl-2蛋白的表達，提高Bax蛋白的表達，而且可以促進Bax從胞漿向線粒體移位，降解激活caspase-3，9蛋白說明苦參堿有可能通過激活內源性線粒體通路促進腫瘤細胞凋亡。

2.2 Fas/FasL通路與凋亡

在外源性通路中，最經典的是Fas/FasL通路，Fas/FasL結合導致Fas胞內部形成活化三聚體，隨后募集FADD（Fas相關死亡結構域蛋白）與Pro-caspase-8形成DISC（死亡誘導信號復合體）。Pro-caspase-8自我剪切被激活形成caspase-8，caspase-8不但可以剪切激活caspase-3,6,7，而且可以啟動線粒體凋亡途徑[16]。黃光弦等[17]在研究苦參堿對小鼠S180肉瘤細胞凋亡作用時發現苦參堿可以上調瘤體組織Fas/FasL表達，增加caspase-8的表達和活性，說明苦參堿可能通過啟動Fas/FasL通路促進凋亡。

2.3 內質網應激通路與凋亡

內質網腔出現未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白積聚或者滯留時，如損傷因素刺激或者泛素蛋白酶體被抑制，會觸發內質網應激和未折疊蛋白反應，內質網發生應激時Bip與PERK解離，PERK自身活化使eIF-2磷酸化，增加ATF4的表達，ATF4通過上調CHOP誘導細胞凋亡[18]。目前蛋白酶體抑制劑可能通過激活內質網應激促進腫瘤細胞凋亡。Junli[19]等在研究苦參堿通過激活（未折疊蛋白反應/內質網應激通路）UPR/ER抑制前列腺癌中發現苦參堿可以抑制蛋白酶體，使前列腺癌Bip表達增加，eIF2a磷酸化增加，CHOP和ATF4表達增加，而且可以抑制Bcl-2蛋白促進Bax蛋白表達，使腫瘤細胞凋亡，說明苦參堿很有可能通過激活UPR/ER通路促凋亡的。苦參堿還可以時間依賴性抑制CyclinD1，CyclinB1，C-myc，CDK1的表達，導致G0/G1期發生周期阻滯，也有可能通過激活UPR/ER通路實現的。曹珊等[20]在研究苦參素對食管癌Eca-109細胞凋亡作用時發現苦參素可以上調CHOPmRNA,下調BIPmRNA，說明苦參素可能通過激活內質網應激凋亡通路，通過上調CHOP誘導細胞凋亡。

細胞凋亡通路是由很多蛋白質參與的網絡系統，這些蛋白質的表達處在一種動態平衡中，隨著細胞內外信號的變化而變化，當發生腫瘤時，這些蛋白表達會失衡，比如抗凋亡蛋白表達增加，這些蛋白作用下游蛋白產生級聯放大反應有可能會促進腫瘤細胞分裂增殖。調控這些蛋白的表達也許可以抑制增殖或者誘導凋亡，從而治療腫瘤，但是這些蛋白作用機制過于復雜，針對某種蛋白的靶向藥有可能通過旁路代償，并沒有很好的效果，所以尋找合適的靶點至關重要。中醫藥或者它的單體是多靶點的，或許可以通過研究苦參堿作用機制尋找敏感的新靶點，或者尋找某些有效的中藥單體或者單體聯合靶向藥可以達到治療腫瘤的效果。

3 端粒酶與凋亡

端粒位于真核細胞染色體末端，由高度重復的DNA序列和端粒結合蛋白組成的，類似帽子結構，具有保護DNA不被降解的功能。染色體每復制一次，端粒縮短一截，一旦端粒過短，持續的DNA損傷應答就會造成p53信號通路被激活，細胞停止分裂或者啟動凋亡。端粒酶由RNA和蛋白質組成的逆轉錄酶，可以使端粒不會隨著分裂而變短。正常人體細胞幾乎檢測不到端粒酶活性，所以端粒會隨著分裂變短，大部分腫瘤細胞端粒比正常細胞短，端粒酶活性卻增強，這與腫瘤細胞不衰老，無限增殖有關，提示人們可以通過抑制端粒酶活性而抑制端粒延長達到抗腫瘤的效果[21]。現在這類靶向分子藥很難應用于臨床，因為對人體有很大不良反應，在作用用于腫瘤的同時也會作用于一些端粒酶活性高的細胞，比如說成體干細胞，苦參堿具有副作用小的優點。張璐燁[22]等研究表明苦參堿可以誘導RB（視網膜母細胞瘤）細胞凋亡，而且可以減弱RB細胞端粒酶活性。李海軍[23]等研究表明苦參堿對人乳腺癌MCF-7有明顯的促凋亡作用，而且端粒酶的活性隨苦參堿的濃度和作用時間增加而下降。說明苦參堿有可能通過抑制端粒酶的活性來發揮促進凋亡作用的。

4 結語

苦參堿作用機制極其復雜，誘導不同腫瘤細胞凋亡的主要激活通路也不都相同，本文主要從三個方面介紹苦參堿對腫瘤細胞的凋亡誘導作用，在此基礎上研究苦參堿的其他作用機制，開發其他藥用價值，或者與一些分子靶向藥聯合應用，將為臨床疑難雜癥的治療打開新天地。