呼吸道九聯檢、血清降鈣素原聯合痰培養與藥敏分析在小兒急性呼吸道感染診治中的應用

陳華俊

（防城港市第一人民醫院，廣西壯族自治區 防城港 538021）

0 引言

小兒急性呼吸道感染是由細菌、病毒以及其他非特異性病原體引起的氣管、支氣管及肺部感染性疾病，是小兒住院的常見疾病之一。如不及時診治，會導致呼吸系統癥狀傾向性地延續到成人并發展為慢性疾病[1]，因此，快速準確的區分不同病原體感染并提供相對應的藥敏試驗及用藥后療效觀察的實驗室指標，對于小兒急性呼吸道感染的診治尤為重要。本文將對呼吸道感染病原體的檢測方法及炎性指標進行分析，綜合論述呼吸道九聯檢、血清降鈣素原聯合痰培養與藥敏分析在小兒急性呼吸道感染診治中的應用價值。

1 呼吸道感染病原體的檢測方法

近年來，隨著新的致病性病原體不斷的發現，相應的檢測方法也在不斷的更新，為臨床呼吸道疾病的診治提供了有力的依據。目前常見呼吸道病原體的檢測方法包括。

1.1 病原體分離培養

痰液的病原體培養主要用于呼吸道感染的病因診斷，合格的痰標本要求白細胞數>25個/低倍視野，鱗狀上皮細胞<10個/低倍視野，或白細胞/鱗狀上皮細胞>2.5/1。定量培養菌量≥107cfu/mL可判定為致病菌。細菌培養一般選用血平板、巧克力平板、中國藍/麥康凱培養基。

病毒分離培養法目前仍是病毒鑒定的經典方法。病毒分離培養方法分為三種：動物培養、雞胚培養和組織細胞培養。組織細胞培養因為操作相對簡單、成本相對較低而被廣泛采用。病毒培養常選用猴腎或人胚腎細胞、二倍體細胞株、Hela、HepG2細胞、犬腎傳代細胞和雞胚接種，如：流感病毒常采用MDCK細胞分離，腺病毒和呼吸道合胞病毒采用HEP2細胞分離等[2]，通過電子顯微鏡、細胞病變效應、凝血實驗、凝血抑制實驗、中和實驗和空斑形成實驗進行鑒定。

傳統病原菌培養方法費時，其檢測時間為4-5天，且有的病原菌生長緩慢、有的是苛養菌、有的病原菌極難培養、還有少數無法培養或者致病力很強的病原菌。病毒培養由于實驗條件要求較高，培養周期較長且操作繁瑣，在普通實驗室應用受限。但現階段，臨床主要采用半自動及自動化微生物分析系統進行痰檢驗，自動化程度更高，覆蓋病原菌面積更寬，準確快速鑒定病原菌的同時，報告結果更完整，包括藥物敏感性，臨床可通過藥敏試驗選擇合適的抗菌藥物。病原菌分離培養是鑒別呼吸道病原菌類型的金標準，因此，痰培養仍有不可取代的地位。

1.2 血清學檢測

血清學檢查是診斷呼吸道病原體感染的主要手段。其檢測機理主要是通過已知的標準抗原或由患者標本分離出的新病原作為抗原與患者血清結合產生抗原抗體反應，在臨床診斷和流行病學的調查中普遍使用。

1.2.1 血凝抑制試驗

某些呼吸道病毒的血凝素能選擇性地使某種或某幾種動物的紅細胞發生凝集，當存在血凝素特異性抗體時，可阻止血細胞發生凝集，稱為血凝抑制(HemagglutjnationInhibition，HI)。血凝抑制試驗用于流感、副流感、腸道病毒、腺病毒的檢測中，微量法血凝抑制試驗是WHO在流感監測工作中推薦使用的標準方法。該方法影響因素為病毒表面的特異性紅細胞抑制物質，所需病毒較多。

1.2.2 中和實驗

用已知抗體血清和待測病毒懸液混合，室溫下作用一段時間后接種敏感細胞，經培養后觀察細胞病變效應或紅細胞吸附現象是否消失，即特異性抗體能否中和相應病毒的感染性。

1.2.3 固相膜免疫實驗

利用硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜和尼龍膜等作為載體,金元素、硒元素和酶促底物置于載體上，抗原和抗體通過穿流或橫流的形式在載體上反應 ,常用的實驗方式有免疫層析實驗、免疫滲濾實驗、酶聯免疫斑點實驗、免疫印跡法等。呼吸道病原體的抗原或抗體皆可通過此方法檢測 ，但因其特異性較差，且易受血清質量的影響，因此應用并不普遍。

1.2.4 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）

用已知的抗原 (抗體)包被在聚苯乙烯微孔上，和待測的抗體(抗原)、酶標的抗原(抗體 )進行反應，通過洗滌分離，繼而加入酶促底物顯色，根據呈色的強弱，判定待測物的有無或多少。該方法是臨床實驗室通過檢測抗原抗體診斷病原體感染應用最廣泛的技術，ELISA方法操作簡單，2-3h即可獲得檢測結果，不需要昂貴的儀器，適合于大批量標本檢測，靈敏度和特異性較好。但ELISA檢測結果易受許多因素影響，如標本中抗原濃度太高可能導致假陰性；血清中非特異性IgG濃度高或含有類風濕因子，或固相包被的抗原純度不夠，則可能導致假陽性結果。

1.2.5 化學發光免疫分析法(Chemiluminescence Ⅰmmunoassay,CLIA)

化學發光免疫分析是將具有高靈敏度的化學發光測定技術與高特異性的免疫反應相結合，是繼放射免疫分析、酶免分析、熒光免疫分析和時間分辨熒光免疫分析之后發展起來的一項新的免疫測定技術。如果將化學發光物質 (如吖啶酯)直接用于標記抗原或抗體，稱為化學發光標記免疫分析，如果采用酶 (辣根過氧化酶或堿性磷酸酶)標記抗原或抗體 ，將化學發光物質作為酶的底物 (魯米諾，金剛烷)，稱為化學發光酶免疫分析。趙宗瑞等采用磁微粒化學發光檢測呼吸道合胞病毒IgM抗體，該方法及試劑精密性良好，與臨床診斷標準符合率較好[3]。化學發光法具有高靈敏度、高特異性、快捷方便等特點，但一般需大型儀器設備，成本較高，因此，此法用于呼吸道病原體的檢測并不廣泛。

1.2.6 免疫熒光技術(熒光抗體技術)

免疫熒光技術是標記免疫技術中發展最早的一種的技術，目前受到較多關注[4]。該技術建立于免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎之上。利用熒光素(異硫氰酸熒光素)標記抗體，用熒光顯微鏡觀察有無顯熒光的抗原抗體復合物存在。測定方式分為直接法和間接法，間接法的敏感度比直接法高5~10倍。該方法是呼吸道病原體，特別是新發高致病性病原體檢測的常用方法。呼吸道九聯檢的基本原理，是用間接免疫熒光法確定呼吸道感染患兒血清標本中的特異性IgM抗體。IgM抗體是個體發育過程中最早合成和分泌的抗體，是初次體液免疫應答中最早出現的抗體,提示新近發生感染，是近期感染的一個有效標志物。呼吸道九聯檢是用間接免疫熒光法檢測呼吸道肺炎支原體、肺炎衣原體、嗜肺軍團菌、Q熱立克次體、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒共 9種呼吸道病原體IgM 抗體。該方法是無放射性污染，具有高度的特異性、敏感性，操作簡便、快捷，可同時檢測九種病原體，覆蓋面廣，成本低，只需配備相應的熒光顯微鏡，無需大型儀器設備，易于推廣，其對小兒急性呼吸道感染的診治指導性強[5-7]。

1.3 分子生物學(核酸擴增法)

核酸擴增法主要是通過指定的DNA引物片段擴增檢測相應病原體的DNA，其特點是具有高效的特異性、敏感性，對多種病原體的檢測普遍有效。其中聚合酶鏈反應(PCR)就是一種行之有效的檢測手段，對不易培養和不適合在培養基上生長的病毒可使用 PCR檢測技術。PCR檢測技術在過去十幾年里飛速發展，已廣泛應用于臨床實驗室的常規檢測，因此利用核酸檢測技術已成為呼吸道病原體體外診斷的新方向。核酸檢測技術在保證高靈敏度和特異度的基礎上，大大縮短了檢測時間，國際上圍繞其建立了多種較為成熟的呼吸道病原體檢測方法。

1.3.1 實時熒光定量PCR

以傳統PCR技術為基礎發展起來的實時熒光定量PCR，使核酸檢測從定性分析發展到定量分析，開創了核酸檢測分析的新局面。目前，實時熒光定量PCR已成為呼吸道病原體核酸檢測的最主要方法。相對于傳統PCR，熒光定量PCR檢測呼吸道病原體有如下優點：①定量檢測可隨時監控病毒擴增情況；②建立了一個封閉式反應檢測環境，大大減少了交叉污染的可能性，同時具有很高的靈敏度及特異度，且所需標本量極小；③檢測時間較傳統PCR短。

1.3.2 多重PCR技術

多重PCR是在同一PCR體系里加入兩對或兩對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR，一次多重PCR可同時檢測、鑒別出多種病原體，在臨床混合感染的鑒別診斷上具有其獨特的優勢和很高的實用價值。如王玉月[8]等報道的九種常見呼吸道病原體副流感病毒 1、2、3型、肺炎支原體、肺炎衣原體、呼吸道合胞病毒、腺病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒的檢測。近年來，多重熒光定量PCR已成為呼吸道病毒檢測的研究熱點。該方法在一個反應體系中可同時實現定量檢測和高通量檢測的目的。Fang等[9]利用一步多重實時定量PCR法可同時檢測乙型流感病毒，甲型 H1N1、H3N2、H5N1流感病毒，其檢測靈敏度可達101~102copies/mL體外轉錄RNA。436例咽拭子標本的陽性檢出率達59.86%(261/436)，同時用病毒分離培養法進行復檢，其陽性檢出率僅為43.35%，這也說明多重實時定量PCR的靈敏度要高于傳統的病毒分離培養。

1.3.3 靶序列富集多重PCR技術

該技術的原理是首先利用低濃度的靶序列特異性引物經巢式PCR擴增富集目標序列，然后引入一對高濃度的通用超級引物對目標序列進行大量擴增，并在此過程中以生物素標記PCR產物。該技術能在一次反應中對多種靶序列進行高度敏感和特異的擴增與檢測并實現對所有目標序列進行均勻、同效率的擴增。此外，Han等將靶序列富集多重PCR的多重擴增技術和液相芯片檢測技術有機結合，建立了常見呼吸道病原體的分子鑒別診斷平臺，將擴增的高效性和檢測的高效性相結合，非常適合于對多種病原體核酸的快速檢測。王鑫磊等[10]報道了鮑曼不動桿菌等14種病原體的檢測。

1.3.4 恒溫擴增芯片法

利用具有鏈置換功能的聚合酶在恒溫(65℃)條件下進行反應,使用熒光染料摻入法進行實時熒光檢測。擴增陽性的樣品會產生類似實時熒光的“S”形擴增曲線,進一步完成對靶基因的擴增和檢測。該方法具有特異性和敏感性更高、試劑耗量低、病原體覆蓋面廣等優勢,具備了對呼吸道感染性疾病的快速診斷能[11-14]。康蓓佩等[15]報道了對13種常見呼吸道感染病原體包括肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、嗜肺軍團菌、肺炎支原體、肺炎衣原體等的檢測。

1.3.5 懸浮陣列技術

該技術采用靶序列富集多重PCR結合多功能懸 浮陣列檢測平臺對毒進行定量分析。由于該技術開始僅使用少量的特異性引物擴增，隨后經超級引物進行大量的放大，提高了敏感度和特異度，基本實現了對所有目標片段以相同的效率進行擴增，從而達到對多種病毒核酸定量檢測的目的。xTAG檢測板技術也屬于懸浮陣列技術。FDA可同時檢測和鑒定12種特定呼吸道病毒的xTAG呼吸道病毒檢測板。xTAG是首個批準上市的可同時檢測和區別A型流感病毒H1和H3亞型的呼吸道病毒檢測板，同時也是首個被用于檢測確定的人類偏肺病毒檢測板。

核酸擴增法敏感性強、特異性高，在呼吸道病原體的核酸檢測中具有較高的實用價值，但其對大量不同的病原體快速檢測和鑒別的能力較差。另外其缺點還在于運用的檢測儀器昂貴，對檢測空間、環境等條件和操作技術人員的要求相對較高，且需要驗收及準入才可以開展該項目的檢測，因此該方法的推廣，特別在基層醫院的應用受到了一定的限制[16]。

2 呼吸道感染的炎性指標

呼吸道感染病原體在體內繁殖或產生毒素，誘發呼吸道感染的發生和發展，隨著病原體及其代謝產物不同程度的擴散，引發炎癥或器官功能障礙。快捷有效的炎性監測指標有利于臨床采取相應的抗感染治療，影響患者的預后，對臨床具有重要價值。目前臨床常用的炎性指標主要包括以下幾類。

2.1 白細胞（WBC）計數及分類

WBC是外周血的有核細胞，通過不同方式不同機制消滅病原體，參加免疫反應，產生抗體，是機體抵抗病原微生物等異物入侵的主要防線，所以臨床多用WBC計數及分類作為診斷和鑒別感染類型的常規指標。其增高見于大部分化膿性細菌引起的感染，減少見于病毒性感染，病毒性感染時常將淋巴細胞計數作為參考指標。白細胞計數及分類檢測速度快，價格低廉，容易被患者接受。但是人體血液中WBC基礎值個體差異大，且WBC總數易受運動、日間變化、精神、藥物等多種因素影響，所以WBC計數用于病原體感染性疾病的診斷敏感性不夠，單憑借血常規的變化作為診斷病原體感染的依據具有一定局限性。

2.2 C反應蛋白（CRP）

CRP是人體肝臟細胞所合成分泌的一種急性時相反應蛋白，是臨床上運用較為廣泛的感染診斷指標之一，在機體受到多種感染或組織細胞受損等非感染因素時，均可引起CRP升高，并且上升較為迅速，在炎癥反應發生后的5-8h就有可能呈現出來。在評價感染所致的炎癥反應方面，CRP不僅可作為敗血癥預示和預后的指標，還常用來幫助鑒別細菌和病毒感染。正常情況下CRP在人體血液中含量甚微，而在細菌感染、炎癥、組織損傷、手術創傷等應激狀態下顯著升高。研究顯示急性損傷和感染后6-12h CRP即可明顯升高，36-50h達峰值，最高可至百倍及1000倍以上[17]，且與炎性反應和組織損傷的程度呈正比，《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第七版）》中也指出多數患者外周血CRP升高，其進行性上升是重型、危重型患者的臨床預警指標。大多數病毒感染的患者值較低，<2~4mg/L，但在部分病毒感染（尤其是病毒性腦膜炎患者）時其水平可有較明顯上升。目前CRP已經作為醫院急診常規檢測項目，是診斷全身細菌性感染的重要標志物，動態觀察CRP可作為細菌感染合理使用抗生素、療效及治愈判斷的指標。陳銳等[18]的研究顯示，小兒急性呼吸道感染早期階段，CRP水平增高,接受相應治療后逐步降低,提示CRP可作為判定急性呼吸道感染程度的主要指標之一。但由于CRP在細菌感染初期血清升高不明顯，不利于臨床做出快速診斷，且在心血管疾病、創傷等狀態下也可升高，因此，CRP對感染缺乏特異性。

2.3 血清淀粉樣蛋白A（SAA）

SAA是一個高度異質性蛋白，由肝細胞產生，其核心的臨床價值在于對病毒性感染的鑒別，可作為診斷病毒、細菌感染的敏感指標。在細菌感染性疾病中，SAA的敏感性高于CRP，上升早、幅度大，尤其是在急性細菌感染早期，檢測SAA的優勢更加顯著；在病毒感染性疾病中，SAA顯著升高，根據其升高的程度或與其他指標聯合運用，可以提示細菌性或病毒性感染，彌補了目前常用炎癥標志物不能提示病毒感染的不足。SAA作為新一代出現的炎癥感染指標，聯合CRP、血常規的診斷，是判斷病毒感染，監測病程及用藥療效的優選血清學指標。應當注意的是，SAA是非特異性的炎癥標志物，需要在結合臨床其他證據的前提下，進行相應的臨床診斷。

2.4 紅細胞沉降率（ESR）

ESR反映的是紅細胞的沉降速度，實質為血漿纖維蛋白原和免疫球蛋白的聚集，是一種非特異性的檢查指標。當機體發生炎性反應時，ESR在2~3 d后即會出現升高，其原因可能為：急性細菌性感染時，血中α1胰蛋白酶、α2巨球蛋白、CRP、轉鐵蛋白、纖維蛋白原等增多，這些炎性反應趨化物均可導致紅細胞聚集，從而使紅細胞沉降加快，ESR數值增加，有時高達100 mm/h以上，因此臨床上將其作為疾病是否在活動期的檢測指標。ESR在炎性反應控制后，下降速度較慢，一般需要幾周時間才能正常，且易受到年齡、性別、紅細胞數量、個體大小、溫度、抗凝劑多少等的影響，特異性和敏感性低，臨床應用存在局限性。

2.5 白介素 6（IL-6）

IL-6是一種具有多種生物活性的細胞因子，由212個氨基酸殘基 組成，主要參與急性期炎癥反應。在感染、應激與創傷等刺激下由活化的T細胞、B細胞及巨噬細胞等大量分泌。IL-6可對內皮細胞與炎性細胞產生直接的激活作用，可加速炎癥反應的速度，對組織器官造成損害。IL-6參與許多疾病的發生和發展，炎癥、病毒感染、自身免疫疾病等均可導致其血清水平升高，而且它的變化比CRP更早，細菌感染時IL-6迅速升高，PCT在2h后增加，而CRP在6h后才迅速增加，因此可用來輔助急性感染的早期診斷。有研究表明，在臨床癥 狀出現前2d，血液中IL-6水平已大幅增加，故早期陽性率較高，對于早期評估感染嚴重程度具有重要價值[19]。此外，IL-6水平與患者感染嚴重程度和預后密切相關，《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第七版）》中指出外周血炎癥因子IL-6進行性上升是重型、危重型的臨床預警指標，因此動態觀察IL-6水平有助于了解感染性疾病的進展和對治療的反應。

2.6 降鈣素原（PCT）

PCT作為血清降鈣素(CT)的前肽物質，由甲狀腺 C細胞分泌產生 ，是一種由116個氨基酸組成的糖蛋白。與傳統的炎癥指標 WBC、CRP等比較，PCT在感染發生僅2h后即可提示系統感染的存在，并能區分細菌感染還是病毒感染。炎癥反應釋放的 PCT 可以被細菌毒素如內毒素直接誘導產生，也可由細胞介導的宿主反應如白細胞介素-1、腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6間接誘導產生，但此誘導過程可以被病毒感染時機體釋放的細胞因子和干擾素阻斷，所以病毒性感染患者的PCT水平一般都很低。當患者出現細菌、真菌感染時，機體的降鈣素原水平會出現明顯的上升。但在病毒感染與非感染性炎癥反應時機體的降鈣素原水平僅會出現輕度上升或無顯著變化。細菌性肺炎患者的PCT水平高于病毒、不典型病原體（軍團菌除外）和結核菌導致的肺炎，PCT水平與肺炎的嚴重程度呈正相關，其鑒別病毒性疾病的敏感性和特異性均高于傳統標志物（WBC、CRP、ESR等）。可見，PCT對細菌性及非細菌性感染具有早期診斷及鑒別診斷的價值[20]。

連續監測PCT水平有助于了解患者的感染情況，指導運用抗生素。目前，國內外許多學者就PCT在血清中的濃度指導使用抗生素進行了一系列的研究，并形成了一整套PCT指導抗生素使用的治療策略[21]。可減少抗生素的使用比例和時間，減少抗生素的濫用，減少耐藥菌群的產生[22-23]。PCT含量反映了細菌感染的程度并作為評價病情嚴重程度的重要指標之一，目前，國內外部分醫院依據PCT檢測結果對小兒急性呼吸道感染患者合理應用抗生素：當PCT<0.25ng/mL,不主張應用抗生素；而PCT≧0.5ng/mL，則主張針對性應用抗生素。因此，血清PCT檢測，能為臨床對患兒早期診治和合理用藥提供重要依據。

3 總結

綜上所述，小兒急性呼吸道感染的病原體及炎性指標檢測的方法層出不窮，各有優缺。引起小兒急性呼吸道感染常見病原體種類有病毒、支原體、衣原體和細菌等，對藥物敏感性各不同。因此，確定病原體種類是個體化治療的依據。病原體檢測的方法有病原體分離培養及鑒定、血清學試驗、核酸檢測等[24]。病原體分離培養及鑒定是診斷 呼吸道感染的金標準，痰培養與藥敏分析鑒定是呼吸道感染常用的病原體檢測方法,仍有其不可取代的地位。核酸檢測成本、設備和人員要求高，基層實驗室難普及，且檢測病原體特異性抗原易受采集標本質量的影響，陽性率低于病原體分離培養[25]，因此存在一定的漏診風險。血清學檢測中，呼吸道九聯檢病原體IgM抗體檢測較其他血清學檢測方法具有簡便、快捷、經濟，特異性高等優點，已廣泛應用于小兒急性呼吸道感染的診斷中。在呼吸道感染炎性指標中，PCT、CRP、IL-6水平的變化較其他炎性指標對于早期判斷急性上呼吸道感染患兒是否為細菌感染更有指導意義，同時還可作為評估預后的指標。研究表明，PCT、CRP、IL-6的敏感度與特異度均較高，但PCT的敏感度與特異度相對更高,且陽性與陰性預測率均明顯高于其他兩項 ，動力學研究表明，PCT、IL-6和CRP在機體感染時出現的時機不同，PCT早于CRP，但晚于IL-6，同時PCT峰值更寬，消退更緩慢。且PCT的約登指數較其余兩項炎癥標志物相比有明顯增加，表明PCT對細菌感染性疾病的診斷價值明顯優于其余兩項，PCT作為判斷是否為細菌感染的指標特異度更好，真實度更高[26-28]。總之，PCT對診斷細菌性和非細菌性感染有重要價值。但細菌性感染是否合并病毒或支原體等的感染，非細菌性感染中病毒和支原體等的鑒別，還需做IgM抗體檢測, 臨床的治療仍需病原體的鑒定與藥敏分析作為參考依據。因此，病原體分離培養中的痰培養與藥敏分析、血清學檢測中的呼吸道九聯檢及炎性指標中的降鈣素原聯合檢測應用，對小兒急性呼吸道感染的診斷和治療具有重要的參考價值。