小檗堿在牙源性干細(xì)胞和口腔疾病的研究進(jìn)展

葉明君，沈山

(暨南大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510620)

0 引言

小檗堿是一種從黃連、黃柏等中草藥中提取分離的小分子異喹啉生物堿[1]，具有多種藥理作用，如抗菌、抗炎、抗癌和抗氧化作用[2,3]。它對消化系統(tǒng)、代謝、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等疾病具有廣泛的藥理活性[4]，是治療肌肉骨骼疾病的潛在藥物[5]。

目前從牙體組織已經(jīng)分離出多種類型的牙源性干細(xì)胞，包括牙髓干細(xì)胞、脫落乳牙牙髓干細(xì)胞、牙周膜干細(xì)胞、根尖牙乳頭干細(xì)胞、牙囊干細(xì)胞[6]。相比較骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，牙源性干細(xì)胞具有提取簡單、侵入性小、不存在與使用有關(guān)的道德考慮等優(yōu)點(diǎn)[6]，近些年被廣泛研究。參與調(diào)控牙源性干細(xì)胞分化涉及多個信號通路，目前已知的信號通路包括絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)、骨形成蛋白(BMP)、Notch、Wnt等[7]。本文描述了小檗堿對牙髓干細(xì)胞、牙周膜干細(xì)胞、根尖牙乳頭干細(xì)胞三種牙源性干細(xì)胞的增殖分化作用和機(jī)制，以及對口腔腫瘤、種植體周圍炎、牙周炎、口腔白色念珠菌感染的藥理作用和機(jī)制作簡要綜述，以期為小檗堿在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究提供一定的思路和參考資料。

1 小檗堿對牙源性干細(xì)胞的作用及機(jī)制

1.1 牙髓干細(xì)胞(human dental pulp stem cells, DPSCs)

DPSCs是從人類的下頜第三磨牙的牙髓組織中提取分離出的，這些細(xì)胞可以分化為成骨細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和神經(jīng)元[8,9]。

1.1.1 促牙本質(zhì)生成

之前研究已經(jīng)證明了DPSCs具有分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞的能力[10]。但是，當(dāng)牙髓受到嚴(yán)重破壞，內(nèi)源性DPSCs的數(shù)量不足以修復(fù)主要的牙齒損傷[11]。根據(jù)Wu等[12]人的體外細(xì)胞研究，小檗堿對DPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化具有積極作用，他們研究發(fā)現(xiàn)小檗堿通過經(jīng)典的Wnt/β-catenin途徑加速了DPSCs的成牙本質(zhì)細(xì)胞分化并增加了成牙本質(zhì)細(xì)胞分化標(biāo)記蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)DPSCs的成牙本質(zhì)細(xì)胞分化。而畢磊等[13]體外研究驗(yàn)證了小檗堿可能通過激活MAPK/ERK信號通路促進(jìn)DPSCs成牙本質(zhì)向分化。

1.1.2 促進(jìn)成骨

研究顯示，小檗堿在PKA、p38 MAPK、Wnt/β-catenin和AMPK信號傳導(dǎo)中起激活劑作用，以增加Runx2和osterix的表達(dá)，從而導(dǎo)致成骨[14]。Runx2編碼一種核蛋白，它是成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，它可以刺激hDPSCs的鈣積累和堿性磷酸酶活性[15]，特別是在成骨分化的早期，MAPK信號通路在Runx2的激活中起關(guān)鍵作用[16]。

Xin等[17]體外研究發(fā)現(xiàn)小檗堿能夠促進(jìn) DPSCs細(xì)胞增殖和成骨，隨后他們進(jìn)一步分析其機(jī)制，小檗堿可以與hDPSCs表面的表皮生長因子受體(EGFR)相互作用并激活MAPK途徑來促進(jìn)hDPSCs的成骨分化。Ma等[18]首次通過靜電紡絲制備了含有不同濃度小檗堿的小檗堿/聚己內(nèi)酯/膠原蛋白支架，研究發(fā)現(xiàn)該支架在體外促進(jìn)DPSCs成骨分化，在大鼠體內(nèi)可加速骨缺損修復(fù)過程。

1.1.3 抑制成脂分化

關(guān)于DPSCs的脂肪分化研究，在一些疾病研究，如糖尿病、肥胖相關(guān)的疾病等，可能是非常有益的[10]。Xing等[19]研究發(fā)現(xiàn)DPSCs在完全間充質(zhì)成脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得脂肪細(xì)胞。之前研究表明小檗堿抑制骨髓間充質(zhì)細(xì)胞成脂相關(guān)標(biāo)志基因的表達(dá)，有效抑制3T3-L1細(xì)胞成脂[20]，Xin等人[17]體外研究發(fā)現(xiàn)DPSCs經(jīng)較高劑量的小檗堿處理后，細(xì)胞中的脂滴明顯下降，這說明小檗堿抑制DPSCs成脂分化，這也從另一方面表示DPSCs的多能性與MSCs非常相似。

1.2 牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cell，PDLSCs)

它是從拔除的人第三恒磨牙牙周組織中分離培養(yǎng)出的，在牙周膜中具有多向分化潛能，能夠增殖分化為成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及成牙骨質(zhì)細(xì)胞[21]。

1.2.1 促進(jìn)成骨

PDLSCs通過不斷增值和定向分化促進(jìn)牙周組織的修復(fù)再生，在維持牙周穩(wěn)態(tài)具有重要作用。Liu等[22]開發(fā)人牙周膜細(xì)胞膜色譜(PDLSC/CMC)與高效液相色譜-質(zhì)譜(LC/MS)聯(lián)用的小檗堿成骨活性成分分析方法，他們發(fā)現(xiàn)小檗堿能促進(jìn)PDLSCs生長，增加堿性磷酸酶的分泌，促進(jìn)礦化結(jié)節(jié)的形成，是一種潛在的成骨成分。他們后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)在適當(dāng)?shù)臐舛?0.1mg/L)下，小檗堿可以在細(xì)胞生長和成骨中發(fā)揮積極作用[23]。關(guān)于機(jī)制，他們研究認(rèn)為EGFR可能是小檗堿與PDLSCs膜之間的靶位點(diǎn)，小檗堿可以與牙周膜干細(xì)胞細(xì)胞膜上的EGFR結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)ERK信號通路，引起核相關(guān)基因FOS上調(diào)，從而加速了PDLSCs的成骨作用[23]。

1.2.2 對糖尿病相關(guān)牙周炎的作用

關(guān)于糖尿病引起牙周炎的病理機(jī)制，學(xué)者目前提出兩種假說，分別是骨代謝異常學(xué)說和菌群失調(diào)學(xué)說[24]。劉靈魯?shù)萚24]通過對糖尿病大鼠模型的研究，證實(shí)小檗堿具有良好的降糖和促成骨作用以及調(diào)節(jié)牙周菌群的功能。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，小檗堿可以抑制牙周炎關(guān)系密切的細(xì)菌，如牙齦卟啉單胞菌，伴放線放線桿菌和中間普氏桿菌[25,26]，先前研究顯示小檗堿可以逆轉(zhuǎn)牙齦卟啉單胞菌感染誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中成骨相關(guān)基因表達(dá)的下調(diào)，恢復(fù)成骨分化[27]。Zhang等[28]研究發(fā)現(xiàn)小檗堿在糖尿病患者的PDLSCs誘導(dǎo)的牙周再生中具有作用，它是通過抑制經(jīng)典的Wnt/β-catenin途徑，從而減弱了糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)對PDLSCs成骨分化能力的抑制。

1.3 根尖牙乳頭干細(xì)胞(stem cell from apical papilla，SCAP)

受感染的未成熟恒牙中的干細(xì)胞，會從受傷的牙齒組織釋放促炎細(xì)胞因子，如TNF-α和IL-1β，它們在正常情況下不表達(dá)或極低水平表達(dá)[29]。TNF-α在炎性階段的根尖周骨缺損中起重要作用，并抑制SCAP成骨細(xì)胞分化[30]。此外，細(xì)菌生物膜及其副產(chǎn)物的水平能夠改變SCAP的成骨分化[31]，Cui等[32]將小檗堿應(yīng)用于具有根尖周炎的大鼠年輕恒牙根管中，他們觀察到新組織沿根部明顯形成。隨后，他們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)小檗堿通過激活SCAP中的經(jīng)典Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)途徑，從而增強(qiáng)了患有根尖周炎的大鼠年輕恒牙的根修復(fù)。

2 小檗堿在與口腔相關(guān)疾病中的作用及其機(jī)制

2.1 口腔腫瘤

小檗堿的抗腫瘤機(jī)制可以概括為五個方面：增殖(包括凋亡、自噬、細(xì)胞周期停滯等)、細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激、炎癥、血管生成和遷移[33]。根據(jù)目前的文獻(xiàn)報(bào)道，小檗堿對口腔腫瘤的作用機(jī)制包括促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯、阻止腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲。

2.1.1 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯

Lin等[34]體外研究發(fā)現(xiàn)小檗堿誘導(dǎo)了口咽癌HSC-3細(xì)胞周期停滯和凋亡，它誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與細(xì)胞色素釋放和ccaspase-3激活相關(guān)。Ho等[35]體外研究表明小檗堿增加人舌癌SCC-4細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生和胞內(nèi)Ca2+水平，從而刺激促凋亡Bax蛋白的表達(dá)，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，而且，與DNA損傷有關(guān)的核酸內(nèi)切酶G的基因表達(dá)，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。他們還在舌癌移植小鼠模體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿每4天一次，每次10mg/kg，可有效減少舌SCC-4腫瘤的生長[36]，這是首次動物體內(nèi)檢驗(yàn)小檗堿作為舌癌預(yù)防劑的作用。其中，小鼠模型體內(nèi)研究與他們之前體外究中的小檗堿濃度(30μmol/L)相似。此外，小檗堿還可抑制人口腔鱗癌細(xì)胞系HN-4的活性，并誘導(dǎo)其凋亡和線粒體膜電位的減少[37]。

2.1.2 阻止腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)在癌癥轉(zhuǎn)移和血管生成中起著重要作用。Ho等[38]體外研究發(fā)現(xiàn)小檗堿可以通過抑制MAPK和NF-κB信號通路，從而抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)，以阻止人SCC-4舌癌細(xì)胞的遷移和侵襲。

2.2 對種植體骨結(jié)合的作用及機(jī)制

Lu等[39]兩位學(xué)者發(fā)現(xiàn)胰島素和小檗堿聯(lián)用可有效降低Ⅱ型糖尿病大鼠血糖，并促進(jìn)種植體的骨結(jié)合[40]，但他們并沒有進(jìn)一步解釋其機(jī)理。Shao等[41]體外實(shí)驗(yàn)表明，小檗堿通過上調(diào)ROS介導(dǎo)的IRS-1信號傳導(dǎo)，從而減輕了高葡萄糖濃度下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨作用受到抑制。Wang等[42]體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)較高濃度(＞30μmol/mL)的小檗堿可在24h內(nèi)有效防止鈦表面上的表皮葡萄球菌生物膜形成。另外，最近一項(xiàng)體外研究結(jié)果表明，在脂多糖(LPS)刺激的炎癥環(huán)境中，小檗堿具有明顯的促成骨作用和抗脂肪形成作用，以上表明小檗堿在與細(xì)菌感染相關(guān)的種植體周圍炎藥物治療中具有潛在的作用[43]。

2.3 牙周炎

2.3.1 抗炎、預(yù)防骨丟失、成骨作用

p38MAPK /NF-κB途徑在促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生中起關(guān)鍵性調(diào)節(jié)作用[44]，小檗堿可以通過抑制MAPK途徑的激活來減少炎性反應(yīng)[45]，其中G蛋白偶聯(lián)受體30(GPR30)為p38MAPK/NF-κB通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器[46]。關(guān)于其成骨機(jī)制的研究，小檗堿通過p38MAPK信號通路或經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路激活Runx2轉(zhuǎn)錄活性，從而促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[20]。

Gu等[47]基于對結(jié)扎誘導(dǎo)的牙周炎大鼠模型的研究，提出小檗堿通過增加GRP30，抑制P38MAPK/NF-κB通路來預(yù)防牙周炎中牙槽骨的丟失和炎癥。Tu等[48]也是使用結(jié)扎方法建立牙周炎大鼠模型，發(fā)現(xiàn)小檗堿可通過下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶的活性來減緩牙周組織降解。有研究顯示，腸道菌群與骨骼代謝之間存在密切關(guān)系[49]。Jia等[50]對大鼠去卵巢建立了實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型，他們發(fā)現(xiàn)小檗堿可通過調(diào)節(jié)腸道菌群來預(yù)防卵巢切除大鼠雌激素缺乏引起的牙槽骨丟失。這是由于小檗堿通過豐富丁酸產(chǎn)生菌，提高腸道丁酸濃度，恢復(fù)腸道屏障，防止血清和牙槽骨中IL-17A相關(guān)的免疫異常，從而改善去卵巢牙周炎大鼠的牙槽骨丟失。王希等[51]研究小檗堿、奧硝唑及聯(lián)合用藥對常見牙周致病菌的體外抗菌活性，發(fā)現(xiàn)二者聯(lián)合用藥對牙齦卟啉單胞菌、伴放線放線桿菌具有協(xié)同抑菌作用，對抑制具核梭桿菌表現(xiàn)為相加作用，對黏性放線菌具有互補(bǔ)作用。因此，他們認(rèn)為二者聯(lián)合用藥可用于治療牙周炎混合感染。

然而，牙周炎的發(fā)展涉及與細(xì)菌和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)的復(fù)雜機(jī)制，在大鼠中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)性牙周炎仍然面臨一定的局限性，關(guān)于小檗堿對牙周炎的藥理作用還需要進(jìn)一步研究其機(jī)制。

2.4 口腔念珠菌感染

近些年來，臨床出現(xiàn)與生物膜形成相關(guān)的咪唑類耐藥性真菌。眾多學(xué)者建立小檗堿與咪唑類的協(xié)同組合以增強(qiáng)咪唑類藥物的藥效作用，尤其是用作抗念珠菌病的一線藥物—氟康唑。

小檗堿對念珠菌生物膜具有與濃度相關(guān)的抑制作用，隨著念珠菌生物膜的成熟而增強(qiáng)，小檗堿在48h時(shí)對念珠菌生物膜的抑制作用最高[52]。細(xì)胞內(nèi)小檗堿不足會導(dǎo)致小檗堿具有中等的抗菌活性，而氟康唑能介導(dǎo)真菌細(xì)胞質(zhì)膜破壞，增加了細(xì)胞內(nèi)小檗堿的濃度[53]。Shao等[54]體外研究發(fā)現(xiàn)小檗堿通過抑制外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，降低了細(xì)胞外羅丹明123(Rh123)。Li等[55]發(fā)現(xiàn)小檗堿積累在白色念珠菌細(xì)胞核中，與DNA結(jié)合，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯和DNA損傷。Xu等[56]體外研究發(fā)現(xiàn)氟康唑和小檗堿處理影響能量代謝中蛋白質(zhì)的表達(dá)，通過增加內(nèi)源性活性氧的產(chǎn)生來誘導(dǎo)白色念珠菌的細(xì)胞損傷。他們后續(xù)又研究表明了氟康唑可以通過抑制麥角固醇的合成來增強(qiáng)氟康唑耐藥的白色念珠菌對小檗堿的敏感性[57]。此外，這種組合還可以下調(diào)外排泵基因CDR1和CDR2的過表達(dá)[58]。

3 總結(jié)與展望

小檗堿源自藥用植物的天然化合物，不但具有多種藥理作用，而且毒性較低、副作用小[59]。本文歸納了小檗堿在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究成果，在牙源性干細(xì)胞研究中，發(fā)現(xiàn)小檗堿能夠通過經(jīng)典的Wnt/β-catenin途徑、MAPK/ERK信號通路促進(jìn)DPSCs的多向增值分化，如成牙本質(zhì)性、成骨性等。通過經(jīng)典的Wnt/β-catenin途徑促進(jìn)hPDLSC、SCAP成骨分化。另外，小檗堿還抑制DPSCs成脂分化。在與口腔其他相關(guān)疾病的研究中，發(fā)現(xiàn)小檗堿通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯、阻止腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲等機(jī)制，發(fā)揮抗癌活性。因小檗堿具有抗菌斑生物膜、促成骨作用和抗脂肪形成作用，對鈦種植體骨結(jié)合也有一定作用，對預(yù)防種植體周圍炎有潛在價(jià)值。通過抑制P38MAPK/NF-κB通路、下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶的活性、調(diào)節(jié)腸道菌群、抑制常見的牙周致病菌等機(jī)制，來預(yù)防牙周炎中牙槽骨炎癥和骨量丟失。因其固有的降血糖作用以及抑制經(jīng)典的Wnt/β-catenin途徑減弱了AGEs對hPDLSCs的成骨分化能力抑制，從而對糖尿病相關(guān)的牙周炎治療有潛在的治療價(jià)值。此外，小檗堿通過增加活性氧、細(xì)胞內(nèi)小檗堿積累、麥角固醇減少和外排抑制來增強(qiáng)氟康唑耐藥白色念珠菌的氟康唑效應(yīng)。最后，由于自身的抑菌效應(yīng)，2mg/mL的小檗堿可與1%洗必泰聯(lián)用作為根管沖洗液[25]，有效地減少了糞腸球菌的感染[60]。

但是，目前小檗堿在口腔領(lǐng)域的研究多是體外細(xì)胞研究，沒有研究揭示與成牙分化相關(guān)的信號通路是存在相互作用、共同影響，還是牙源性干細(xì)胞成牙分化的信號通路具有特異性或共性。因此后續(xù)研究還需要繼續(xù)深入以探討其作用機(jī)制，發(fā)揮其在組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的優(yōu)勢[61]。值得一提的是，還沒有文獻(xiàn)報(bào)道小檗堿對脫落乳牙牙髓干細(xì)胞，牙囊干細(xì)胞的增值分化影響。在小檗堿對口腔相關(guān)疾病的作用中，小檗堿在口腔腫瘤的作用機(jī)制研究多是10多年前的體外和一些動物體內(nèi)研究，近些年小檗堿對口腔腫瘤的藥理作用機(jī)制研究較少，所以揭露的作用機(jī)制目前只有兩種。如今臨床應(yīng)用的化療藥物存在嚴(yán)重的副作用，如骨髓抑制和貧血[62]。因此，如果期待小檗堿作為替代藥物或者聯(lián)合藥物來克服這些缺點(diǎn)，后續(xù)還需要深入地研究其機(jī)制及其安全性。另外，小檗堿在具有挑戰(zhàn)性的微生物感染治療中存在優(yōu)勢，但其體內(nèi)抗菌活性不足以取代臨床上現(xiàn)有的抗菌劑[43]，將小檗堿作為先導(dǎo)化合物來修飾其結(jié)構(gòu)，以期增強(qiáng)其抗菌活性或者其他藥理活性[63]。