淺談冷凍切片中冰晶的形成和解決方法

范冬梅，許宏烽，沈溪明

(中山大學孫逸仙紀念醫院病理科，廣東 廣州 510000)

0 引言

冷凍切片，是通過各種方法使組織快速降溫后，冷凍成具有一定硬度，切出薄片在顯微鏡下進行觀察得出病理診斷結果[1]。術中冷凍切片，可為臨床醫生提供病理診斷結果以決定手術方式，因此高質量的冷凍切片為病理報告的準確性提供可靠的依據，而低質量的冷凍切片往往會給病理醫生造成診斷困難，甚至會引起誤診[2-4]。冷凍切片中冰晶形成，是冷凍切片最難避免、也是最容易影響診斷的問題之一。冷凍組織迅速玻璃化對減少冷凍切片中冰晶的形成至關重要，冰晶的形成一般在切片的空白區，會導致細胞內空泡增多。鏡下顯示：組織擠壓、形態難辨，其間夾雜有大小、形態不一的空隙，給診斷造成困難[5]。如何減少術中冷凍切片冰晶的形成，一直以來都是病理技術員需要克服的一個技術難題。本文根據我們的經驗，分享一些減少冰晶形成的解決方法，來提高冷凍切片質量，以期為病理醫師精確診斷和臨床醫生選擇手術方案提供可靠保證。

1 材料和方法

1.1 標本

選取我院病理科2020年11月至2020年12月間符合冷凍切片標準的新鮮組織(包括肝、腎、乳腺等組織)。

1.2 器械設備

LEICA CM1950 冷凍切片機、OCT包埋劑、樣本托、冷凍錘、一次性刀片、毛筆、載玻片、NQ100冷凍染色機，顯微鏡。

1.3 方法

分別從組織取材厚度、有無吸干組織水分、加入OCT包埋劑的量、組織冷凍方式、組織粗修深度和復溫等多個因素進行實驗，鏡下觀察切片中冰晶形成情況。

1.3.1 組織取材厚度

將新鮮組織標本均以1.5cm×1.5cm取材，取材厚度分別為0.3cm和0.5cm(用濾紙吸干組織表面水分)，冷凍切片機機箱溫度設置在-20℃～-15℃，將兩組組織放在加了包埋劑的樣本托上，再用冷凍錘速凍壓平，取下托盤架固定到冷凍切片機的冷凍頭上開始切片，用3%乙醇冰醋酸固定液進行固定，之后放在NQ100冷凍染色機上進行常規HE染色，最后中性樹膠封片。

1.3.2 有無對組織水分進行吸干

將新鮮組織標本均以1.5cm×1.5cm取材，取材厚度均為0.3cm，一組對組織表面水分使用濾紙吸干，另一組不進行處理，將兩組組織放在加了包埋劑的樣本托上，再用冷凍錘速凍壓平，取下托盤架固定到冷凍切片機的冷凍頭上開始切片，用3%乙醇冰醋酸固定液進行固定，之后放在NQ100冷凍染色機上進行常規HE染色，最后中性樹膠封片。

1.3.3 加入OCT包埋劑的量

將新鮮組織標本均以1.5cm×1.5cm取材，取材厚度均為0.3cm(用濾紙吸干組織表面水分)，一組在組織包埋時加入適量的OCT包埋劑在其表面，可明顯看到冷凍組織，另一組則加入過量的OCT包埋劑，使其覆蓋充滿組織表面，無法看清組織，再用冷凍錘速凍壓平，取下托盤架固定到冷凍切片機的冷凍頭上開始切片，用3%乙醇冰醋酸固定液進行固定，之后放在NQ100冷凍染色機上進行常規HE染色，最后中性樹膠封片。

1.3.4 組織冷凍速度

將新鮮組織標本均以1.5cm×1.5cm取材，取材厚度均為0.3cm(用濾紙吸干組織表面水分)，將兩組組織放在加了包埋劑的樣本托上，一組使用冷凍錘對組織進行速凍壓平，另一組不使用冷凍錘，使其自然冷凍，取下托盤架固定到冷凍切片機的冷凍頭上開始切片，用3%乙醇冰醋酸固定液進行固定，之后放在NQ100冷凍染色機上進行常規HE染色，最后中性樹膠封片。

1.3.5 組織粗修深度

將新鮮組織標本均以1.5cm×1.5cm取材，取材厚度均為0.3cm(用濾紙吸干組織表面水分)，將組織放在加了包埋劑的樣本托上，再用冷凍錘速凍，取下托盤架固定到冷凍切片機的冷凍頭上開始切片，選取表面和不同粗修深度的組織切片，用3%乙醇冰醋酸固定液進行固定，之后放在NQ100冷凍染色機上進行常規HE染色，最后中性樹膠封片。

1.3.6 復溫

將新鮮組織標本均以1.5cm×1.5cm取材，取材厚度均為0.3cm(用濾紙吸干組織表面水分)，將組織放在加了包埋劑的樣本托上，再用冷凍錘速凍，選取用手捂(手指輕輕覆蓋1-2秒)組織升溫和不進行升溫的組織切片，用3%乙醇冰醋酸固定液進行固定，之后放在NQ100冷凍染色機上進行常規HE染色，最后中性樹膠封片。

1.4 結果觀察

由兩名主治以上醫師進行雙盲閱片，鏡下觀察，觀察整張切片中有無冰晶形成的區域及冰晶形成的位置。

2 結果

當取材厚度為0.3cm，用濾紙吸干組織表面水分，加入適量的OCT包埋劑，用冷凍錘加速冷凍組織和選取表面組織切片時，鏡下觀察組織結構清晰，形態基本完整，薄厚均勻，紅藍對比鮮明，透明度較好，極少有冰晶形成，當取材厚度為0.5cm、過量的OCT包埋劑、不使用冷凍錘速凍組織和粗修過深都會影響冰晶的形成，導致組織切片中出現空洞及輕微裂隙，使鏡下觀察時組織形態變形，難以辨認(如圖1、圖2和圖3)。當組織質地較脆時，選擇適宜的溫度或粗修之后用手捂組織稍復溫后進行切片，組織結構清晰，形態基本完整，薄厚均勻，紅藍對比鮮明，透明度較好，若未使用復溫方式切片會影響切片質量(如圖4)，但組織中水分凍融后二次結晶，會容易形成大量不規則分布在細胞質內和核內的冰晶(如圖2和圖3)。

3 討論

新鮮組織不經任何固定脫水等處理，直接在低溫恒冷切片機冷凍后馬上進行切片，稱為冷凍切片。冷凍組織制片的原理是利用物理降溫的方法，借助冷凍切片機的低溫來迅速冷凍組織，使組織在短時間變硬，以用于制備冷凍切片[4]。目前，手術中需要病理診斷的手術病例逐年增多，臨床手術醫生對術中病理報告的依賴性也有所增加，所以冷凍切片的質量是手術中病理診斷的重要保證。理想的切片應做到切片完整、較薄和均勻、無皺折、無刀痕、貼片恰當。冷凍切片時每個操作都能影響冰晶的形成，從而影響制片質量及病理診斷。如何制作出一張能符合診斷要求的高質量冷凍切片，需要病理技術員有豐富的切片經驗和技術以及把控切片制作全過程。

水冷凍凝結成為固態有兩種主要形式：晶體態(結晶成核轉變為規整排列固體的形式)和玻璃態(無序固體的形式)。玻璃化是指水轉化為非晶體(玻璃態)的固化過程，其本質是冷凍固化溫度降得足夠快時，水不經歷結晶過程而直接變成過冷液體，最終形成玻璃態。冷凍組織迅速玻璃化對保證冷凍切片組織形態至關重要[5,6]。

在實際的冷凍切片制片工作中，導致冷凍組織冰晶形成的因素有多種，不同的因素均可不同程度地導致冰晶的形成，在組織進行冷凍的過程中，如果緩慢冷凍，組織中的水分會逐漸聚集形成冰晶的晶核，并與周圍的水分子繼續凝結，形成更大的水分子，一旦冰晶形成，便會對周圍的組織細胞進行擠壓、破壞，導致組織細胞形態破壞[7,8]。冷凍切片中常見的冰晶為細胞外冰晶和細胞內冰晶，細胞外冰晶出現在細胞外，形態表現為不規則透明間隙，同時出現細胞收縮，組織形態結構變形，細胞的收縮導致冷凍切片染色不佳。細胞內冰晶出現在細胞內，以出現的的部位不同，可以分為胞質內冰晶和胞核內冰晶，細胞內冰晶的形成，一般僅僅對細胞的局部結構造成擠壓，細胞局部形態收到影響，但整個細胞不出現明顯收縮，組織的形態結構不出現明顯變形。在生物體內，細胞中水中占80%～90%，水在各種組織中含量最多，我們對組織中的水分進行吸干，可以減少組織中的水分含量，進而減少冰晶的形成，由于我們日常使用的冷凍樣本托較小，含有的致冷能量較少，使用冷凍錘致冷時，可以使組織溫度迅速降低，加快組織冷凍速率，此外，組織厚度較薄以及適量的包埋劑均可使組織溫度迅速降低，抑制晶核的形成，減少冰晶的形成，對于同一冷凍組織，在組織進行速凍時，表層的組織迅速降低，先冷凍凝固，內層組織溫度逐漸降低，導致組織表面與內層在冷凍速度上存在差異，使得內部組織有時間形成晶核，進而形成冰晶，導致組織內部存在冰晶，在鏡檢組織切片時，可以看到細胞之間以及細胞內部存在空洞，破壞了組織細胞的形態結構。因此，對冷凍組織取材厚度適中，對組織表面的體液或水分進行吸干處理，加入適量的冷凍包埋劑，并利用冷凍錘對組織進行壓平、速凍后，盡可能切全后切取表層組織，選擇合適的溫度和復溫進行染色制片所制得的切片效果最佳，避免對組織進行粗修、深切，既可減少組織切片中的冰晶影響，又可減少組織損耗，特別是對于腫瘤病灶較小的組織，可以盡可能保留病變組織用于冷凍后石蠟切片的常規HE染色及免疫組化染色診斷。