青蒿琥酯干預對伴糖尿病牙周炎大鼠腸道組織TNF-α、 MMP-9及Caspase 3表達的影響

袁 仲，農曉琳，陳 怡，梁 晨

糖尿病作為臨床上常見的慢性內分泌疾病，獲得極大的關注，然而其發病機制目前尚不明確。糖尿病的發生發展伴隨著多種并發癥，其中牙周炎作為一種常見的口腔疾病，因其與糖尿病關系密切又被稱為糖尿病的“第六大并發癥”。牙周炎是主要由牙周菌斑引起，臨床表現為牙周軟硬組織局部破壞。伴糖尿病牙周炎因為口腔菌群進一步紊亂、牙周組織浸潤性炎癥加重而具有臨床癥狀嚴重、治療困難易反復等特征。糖尿病與牙周炎往往共存并且相互促進與影響，二者的交互作用又會導致全身多靶器官進一步受損。已有研究指明，體內的高血糖環境會引起腸道屏障功能受損從而引發腸源性感染[1]；另一方面，牙周菌群亦可引起腸道菌群紊亂從而導致腸道內廣泛炎癥損害[2]。所以我們推測，伴糖尿病牙周炎相較單純糖尿病或牙周炎可能會進一步加重腸道的破壞而引發相應并發癥。

在前期研究中，青蒿琥酯(artesunate,ART)作為青蒿素的水溶性衍生物已經證實在糖尿病多靶器官損傷中的治療作用。因其具有優秀的抗炎[3]、抗菌[4]等能力，ART在伴糖尿病牙周炎的治療中可能存在一定的價值。本研究試圖通過構建伴糖尿病牙周炎大鼠模型，采用青蒿琥酯干預治療后，觀察青蒿琥酯對伴糖尿病牙周炎大鼠腸道組織的影響，并探究其可能存在的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

取32只6周齡，體重190～210 g，健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(由廣西醫科大學動物實驗中心提供，實驗設計經廣西醫科大學動物倫理委員會批準通過)，隨機分為4組，即健康對照組、糖尿病組、伴糖尿病牙周炎組以及ART干預組。分籠適應性喂養1周，自由攝食及攝水。

1.2 各組實驗模型建立

第1周末，除健康對照組8只動物外，其余各組共24只大鼠均按下述方法制備1型糖尿病模型。大鼠禁食12 h后，鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)于腹膜下注射60 mg/kg，單次注射。注射3 d后進行糖尿病的成模鑒定，以大鼠尾部靜脈血空腹血糖值>16.7 mmol/L作為1型糖尿病模型建立成功指標，且2周內3次重復測量均穩定>16.7 mmol/L者作為糖尿病成模動物進入牙周炎建模實驗。

活化保存菌種牙齦卟啉單胞菌菌株(P.gingivalisATCC33277)接種于培養基中，厭氧培養細菌并配制成新鮮菌液。于第3周末在前述成功建立1型糖尿病大鼠模型的基礎上，隨機選取16只糖尿病大鼠在其雙側上頜第二磨牙采取結扎絲結扎和涂布菌液的方法構建伴糖尿病牙周炎模型。0.5%戊巴比妥鈉麻醉后，探查雙側上頜第二磨牙并分離牙齦，采用 4-0 正畸結扎絲在齦溝內結扎，將配置完備的牙齦卟啉單胞菌菌液涂布于結扎絲上及齦溝內深入結合上皮處。建模后每周探診并補充涂布菌液，若牙周袋形成則將結扎絲進一步推進至牙周袋底。至第10周末，伴糖尿病牙周炎大鼠建模成功。

1.3 藥物干預及標本采集

第10周末，大鼠糖尿病及牙周炎模型穩定，一般狀況穩定。對ART干預組大鼠進行ART干預，健康對照組、糖尿病組、伴糖尿病牙周炎組均給予生理鹽水對照干預。本實驗采用60 mg/kg濃度ART對ART干預組大鼠進行灌胃處理。每天干預1次，共持續4周。在ART干預過程中對健康對照組、糖尿病組以及伴糖尿病牙周炎組大鼠每日給予同量生理鹽水灌胃處理。第14周末處死大鼠，剪取距回盲端5 cm的回腸2 cm長，于4% 多聚甲醛溶液中固定保存。

1.4 觀察指標

1.4.1 腸道上皮組織病理學觀察 大鼠腸道組織常規固定、脫水、包埋，腸腔橫斷面切片4 μm 厚，每份標本各切片4張備用，蘇木精-伊紅(HE)染色對各組大鼠腸道上皮組織病理學改變進行觀察。

1.4.2 免疫組織化學染色觀察腸道上皮腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、基質金屬蛋白酶-9(matrix metallopeptidase-9, MMP-9)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3(cysteinecontaining aspartate-specific proteases 3, Caspase 3)表達 取上述切片，浸沒于枸櫞酸溶液中，使用高壓鍋進行高壓抗原修復。5 min后將其取出自然冷卻，洗滌后在3%過氧化氫溶液中浸泡。PBS沖洗，山羊血清封閉。選擇一抗：兔抗鼠TNF-α、MMP-9、Caspase 3(均購自Bioworld公司，中國)，滴加1∶100稀釋抗體。過夜后滴加羊抗鼠抗兔通用型HRP標記二抗(武漢博士德公司，中國)。二抗孵育后PBS沖洗3次，DAB顯色，復染，干燥，封片。以腸道上皮組織內棕黃色顆粒狀黃染作為陽性指標，鏡下隨機選取5個視野，采用Image Pro Plus 6.0圖片分析軟件分析計算腸道上皮組織中TNF-α、MMP-9及Caspase 3光密度值。

1.5 統計學方法

SPSS 22.0統計分析軟件處理分析實驗結果，4組數據比較先進行方差齊性檢驗。如果方差齊則對數據行單因素方差分析，并采用SNK-q做組間兩兩比較；若方差不齊則行秩和檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 腸道組織HE染色觀察結果

各組大鼠回腸HE染色圖像見圖1。可見健康對照組大鼠腸道上皮各層分界清楚、排列整齊，肌層完整無破壞，腸腺排列較整齊，絨毛呈指狀無萎縮無斷裂。糖尿病組大鼠腸道黏膜結構有破壞，具體表現為肌層損傷，腸絨毛萎縮，腸腺減少并伴有變形。伴糖尿病牙周炎組大鼠腸道上皮破壞較糖尿病組表現明顯且嚴重，具體體現為肌層損壞加重伴有“剝脫樣”改變，腸腺萎縮變形周圍多淋巴細胞浸潤，腸絨毛排列不整伴有粘連。ART干預組大鼠腸道肌層完整，絨毛排列整齊，淋巴細胞浸潤較伴糖尿病牙周炎組減輕。

圖1 各組大鼠腸道組織HE、免疫組化染色結果( ×200)

2.2 腸道組織TNF-α, MMP-9及Caspase 3免疫組化染色觀察結果

TNF-α是炎癥信號通路的一種表達因子，在正常腸道組織中較少表達在絨毛內細胞間質以及黏膜下層，表現為棕黃色及棕紅色顆粒狀、片狀深染。根據圖像分析結果，伴糖尿病牙周炎組TNF-α陽性表達水平最高，糖尿病組陽性表達次之，ART干預組及健康對照組表達最低。其中，ART干預組與健康對照組差異無統計學意義(P>0.05)，其余健康對照組、糖尿病組、伴糖尿病牙周炎組及ART干預組兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1、2。

MMP-9是一種基質金屬蛋白酶，在正常腸道中腸絨毛及腺泡周圍細胞間質較少表達或不表達。圖像分析結果示：伴糖尿病牙周炎組及糖尿病組MMP-9陽性表達水平最高，ART干預組表達次之，健康對照組MMP-9表達最低。各組兩兩比較，ART干預組與健康對照組、糖尿病組與伴糖尿病牙周炎組之間差異無統計學意義(P>0.05)，其余各組差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1、2。

Caspase 3參與調控細胞凋亡，在正常腸道上皮中不表達或很少表達。在伴糖尿病牙周炎組及糖尿病組中Caspase 3表達最高，在ART干預組表達較低，在健康對照組中表達最低。SNK-q分析，伴糖尿病牙周炎組與糖尿病組差異無統計學意義(P>0.05)，其余均有統計學意義(P<0.05)。見圖1、2。

*:P<0.05, **:P<0.01, ***:P<0.001, n=8

3 討 論

糖尿病會使全身多靶器官處于慢性高炎癥狀態從而導致多種并發癥狀。已有研究表明，糖尿病會引起腸道內環境改變，繼而引發腸道內慢性炎癥改變、腸道通透性增加、腸道上皮破壞等一系列病損。其中，腸道微生物失衡可能作為糖尿病致腸道炎癥的一條重要途經。Zhang等[5]通過16SrDNA腸道菌群測序的方法，發現隨著葡萄糖耐受不良的進展，腸道內擬桿菌屬和梭菌屬富集程度發生波動，鏈球菌則呈現持續下降趨勢。而這種菌群結構紊亂，則會導致腸腔內乳酸菌等益生菌顯著減少，革蘭陰性腸道病原菌占比大幅增加，產生大量內毒素，使腸道屏障功能受損，腸道上皮炎癥浸潤。Thaiss等[1]發現在糖尿病的小鼠模型中，高血糖環境通過腸道上皮細胞的葡萄糖轉運蛋白(glucose transporter type 2, GLUT2)來驅動腸屏障通透性，由此得出高血糖介導的屏障破壞會導致微生物產物的全身流入并增加腸道感染。

口腔和腸道通過消化道連接，二者在微生物構成及致病方面有著多種多樣的聯系。牙周炎作為口腔局部炎癥會對腸道內菌群結構組成產生遠隔影響。Tamotsu等[6]對小鼠口服牙齦卟啉單胞菌以觀察腸道內微生物改變，發現口服牙齦卟啉單胞菌后腸道內擬桿菌及普氏菌增加，腸道菌群結構發生改變。這表明，與牙周炎關系密切的細菌會導致腸道內細菌構成發生改變。然而值得注意的是，牙齦卟啉單胞菌并不直接在小鼠腸道中檢出，由此可推斷牙周炎并不通過細菌直接定植方式改變腸道菌群結構，而是通過其他途徑影響腸道內環境。Nakajima等[7]研究發現，小鼠口服牙齦卟啉單胞菌會引起血清內毒素水平增加，且腸道上皮中與腸道通透性相關蛋白基因水平下調。這提示牙周炎可能通過牙周組織內過量革蘭陰性菌釋放內毒素進入外周血，通過體循環至腸道組織，引發腸道上皮內廣泛炎癥，破壞腸道屏障，進入腸腔，改變腸道微生態結構。

由此可見，糖尿病及牙周炎可分別引起腸道上皮受損及炎癥。因此，伴糖尿病牙周炎作為臨床上常見的一種伴發疾病會引起腸道組織更嚴重的破壞。通過實驗我們證實了這一點：糖尿病及伴糖尿病牙周炎大鼠相較健康對照組大鼠腸道組織結構有破壞，TNF-α、MMP-9及Caspase 3表達均較高，且伴糖尿病牙周炎組大鼠較糖尿病組大鼠TNF-α、MMP-9及Caspase 3表達更突出。

在對糖尿病及牙周炎兩種疾病的研究中，炎癥信號通路一直是關注的焦點。TNF-α是核因子-κB(nuclear factor kappa-B， NF-κB)信號通路的一種促炎因子，其在糖尿病相關靶器官及牙周炎癥組織中均有高表達[8]。在本實驗研究中，伴糖尿病牙周炎大鼠腸道上皮內TNF-α表達較正常大鼠顯著增加，提示伴糖尿病牙周炎通過炎癥信號通路影響、破壞腸道上皮組織。MMP-9在炎癥性腸病領域有著較為重要的作用。Garg等[9]發現，MMP-9能夠調節腸道組織中杯狀細胞的分化，這改變了腸道黏膜的防御屏障，從而導致了腸道炎癥。也有研究發現，牙周炎患者牙周菌群的構成與TNF-α、MMP-9等因子有顯著的相關性[10]。本次實驗結果得出：與正常大鼠相比，糖尿病及伴糖尿病牙周炎大鼠腸道組織中MMP-9水平提高，由此可見伴糖尿病牙周炎對腸道炎癥損傷作用顯著。Caspase 3是一種半胱氨酸蛋白酶，其在細胞凋亡中起到重要作用。有研究指出，脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)在腸道內過量生成會導致腸道上皮細胞凋亡，Caspase 3表達隨之增加[11]。另外有研究表示，TNF-α可作為獨立因子誘使腸道上皮細胞觸發凋亡信號通路引起腸道上皮損傷[12]。在本實驗中，糖尿病組及伴糖尿病牙周炎組較健康對照組大鼠Caspase 3水平增加，且伴糖尿病牙周炎大鼠增加更明顯，這提示糖尿病及牙周炎二者交互作用使腸道上皮細胞非正常凋亡。所以我們推測，糖尿病通過糖基化終產物途徑(AGEs-RAGE)，激活了NF-κB信號通路，引發TNF-α、MMP-9等下游因子表達增加[13]；另一方面，牙周炎導致的牙周菌群失調也進一步促進了LPS、TNF-α、MMP-9等的表達。而LPS、TNF-α的過表達，引發了腸道上皮內細胞凋亡通路的激活，從而導致Caspase 3等凋亡因子的陽性表達。

ART是青蒿素的一種倍半萜內酯衍生物，因其是青蒿素的水溶性衍生物，在用藥方面具有多種給藥途徑，所以在臨床上應用廣泛。已有研究表明，ART具有多種藥理作用，如抗瘧疾[14]、抗炎、抗腫瘤[15]、抗真菌等[16]。我們的前期研究發現ART具有一定程度的抗瘢痕形成能力[17]；ART對糖尿病大鼠腎臟、心臟等靶器官具有一定的治療作用[18-19]。值得關注的是，有研究表明ART對多種細菌表現出明顯抗菌動力學特征。Li等[20]指出ART可以有效抑制大腸桿菌抗藥性，促進β-內酰胺類抗生素對大腸桿菌的抑制作用。ART可通過改善腸道菌群結構，抑制肝硬化所致腸道菌群移位并一定程度減輕肝硬化程度[21]。在Kim等[4]的研究中發現，青蒿素及其衍生物對伴放線聚集桿菌、中間普氏菌等多種牙周致病菌表現出明顯的抗菌活性，分析指出因其可對牙周炎相關炎癥因子及牙周炎進程產生抑制作用，從而抑制各類牙周致病菌。有研究ART對風濕性關節炎的作用機制中發現，ART可以通過抑制磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)等通路降低下游產物MMP-9的表達[22]，這與我們的實驗結果相符，表明ART可通過降低MMP-9的表達從而緩解腸道炎癥。另有研究表明，ART可以通過抑制NF-κB的表達從而影響下游產物亞硝酸鹽、TNF-α的產生，達到抑制高血糖環境所致的慢性炎癥作用[23]。已有研究證實ART對1型糖尿病小鼠有確切的治療作用，并可有效抑制胰腺中TNF-α、IL-6等促炎因子的表達[24]。而在牙周炎的治療中，研究人員亦發現ART有劑量依賴性地抑制NF-κB誘導的破骨細胞及LPS的生成的作用[25-26]。在本次實驗中，我們發現ART對伴糖尿病牙周炎大鼠腸道組織形態損傷、炎癥浸潤及上皮細胞凋亡有明顯抑制作用，腸道組織恢復情況良好。我們推測，ART可能通過抑制牙周致病菌及抑制腸道內革蘭陰性致病菌，調整腸道菌群結構，減少內毒素產生，從而恢復腸道屏障，抑制腸道上皮炎癥。另一方面，ART的干預可能通過抑制PI3K/Akt、NF-κB等通路，減少因糖尿病及牙周炎導致的TNF-α、MMP-9及Caspase 3等因子的過表達，從而達到改善腸道上皮的破壞。

綜上所述，我們初步發現伴糖尿病牙周炎對腸道組織的破壞，糖尿病及牙周炎二者協同作用，加重腸道上皮炎癥及細胞凋亡。ART干預后腸道上皮結構明顯改善，TNF-α、MMP-9及Caspase 3炎癥因子及細胞凋亡因子顯著下調，提示ART對伴糖尿病牙周炎腸道損傷有一定治療作用，關于具體通路上下游因子的研究仍需進一步探討。可以進一步探討ART作為治療伴糖尿病牙周炎的有效藥物與胰島素的對照研究以及研究二者聯合應用的治療效果及機制。