間充質干細胞來源的外泌體在骨性關節炎治療中的研究進展

孟竹，張君濤

(1.天津中醫藥大學第一附屬醫院、國家中醫針灸臨床醫學研究中心，天津 300193；2.天津中醫藥大學第一附屬醫院骨傷科，天津 300193)

0 引言

骨性關節炎(osteoarthritis，OA)是全世界成年人中最常見的退行性關節疾病，其特點是關節軟骨的慢性進行性破壞，嚴重影響軟骨及周圍組織的退行性關節疾病[1]，其發病基礎是關節軟骨退化損傷、關節邊緣和軟骨下骨反應性增生。OA的發生發展就是軟骨單位(由關節軟骨、鈣化軟骨、軟骨下皮質骨和骨小梁形成一生物復合物)的組成、功能特性以及結構發生了變化[2]。隨著人口老齡化加劇及肥胖人群逐漸增多，OA的發病率呈逐年升高趨勢[3]，同時也受生活環境、遺傳及職業等其他因素影響，OA有望成為第四大致殘原因[4]。然而，目前OA的臨床治療手段主要包括抗炎鎮痛藥物、軟骨保護劑、關節鏡手術、關節置換和中醫理療等，目的都在于減輕疼痛，保存軟骨功能，延緩關節退變，改善畸形，維持關節的正常活動，不能從根本上解決問題，無法阻止疾病的發生發展。因此，尋找OA新的治療策略一直是骨科領域的研究熱點之一。

隨著科技發展，以干細胞為主的再生醫學以及生物治療是近些年來的研究熱點之一。間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)是一類具有自我更新能力的多潛能祖細胞，具有來源廣、分化能力強[5]等特點。相較于其他干細胞，MSC獲取及儲存相對容易，在具有強大分化能力的基礎上，免疫排斥更小，經過不斷實驗，MSC已經成為再生醫學領域中應用最廣泛的干細胞[6]。同時大量證據表明MSC治療OA可獲得較好的療效[7-9]。但由于MSC受供體影響大量獲取困難、存活率有限以及對微環境敏感等諸多原因[10-12]，使得在臨床應用還存在一些挑戰。隨著深入研究，發現MSC不僅通過自身增殖分化修復受損組織，還能通過分泌——外泌體(exosome，Exo)來改變微環境，進而調控細胞增殖、分化、凋亡等生物學功能，間接實現修復治療作用。這為MSC直接應用于臨床提供了另一思路，同時也為OA的治療提供了新的治療策略。本文就不同間充質干細胞來源的外泌體在骨性關節炎中的表達和作用機制進行綜述。

1 外泌體

外泌體是一種由細胞分泌的直徑為40-150 nm、密度范圍為1.09-1.18 g/mL的具有雙層磷脂膜結構的囊泡樣物質，其內容物包括多種蛋白標志物、DNA 片段及RNA。其功能往往表現為細胞間通訊介質，可遠距離膜性轉運供體細胞內的生物小分子至受體細胞發揮其調控作用[13]。1983年，Johnstone首次在綿羊網織紅細胞中發現外泌體并命名為“exosome”。當時被認為是細胞排泄廢物，在之后的十多年中并未受到重視，直至1996年G Raposo等發現類似于B淋巴細胞的免疫細胞也會分泌抗原呈遞外泌體，所分泌的外泌體可以直接刺激效應CD4+細胞的抗腫瘤反應。2007年H Valadi等進一步發現細胞之間可以通過外泌體中RNA進行遺傳物質交換。從此外泌體逐漸引起了研究者們的重視。

外泌體由于其獨特的生物學特征，在多種疾病的診斷及治療中都有著諸多應用，其作用機制也被不斷明確，如腫瘤可通過外泌體傳輸特異性miRNA、LncRNA來調節腫瘤微環境以及促進腫瘤的轉移侵襲等多個生物學過程[14]。2010年，間充質干細胞來源的外泌體被首次報道，實驗證明其可明顯減輕小鼠心肌缺血再灌注損[15]。

2 間充質干細胞來源外泌體

間充質干細胞來源的外泌體(MSC-Exosomes，MSC-Exo)定義了50-200納米的小泡，這些小泡在間充質干細胞內的多泡體與質膜融合時分泌到細胞外空間[16]。相較于MSC，MSC-Exo具有與之相似的生物學功能，在此基礎上還具有體積小、免疫原性低，并且不會永久作為移植物而存在，并且更易于優化體外擴增[17]等優勢。總之，MSC-Exo具有更高的安全性、有效性及經濟性，臨床應用前景更為廣闊。

MSC-Exo不僅表達Exo特異性表面標志物CD9和CD81，還表達間充質干細胞特異性表型CD29、CD44、CD73和CD90[18]等。此外除了攜帶多種蛋白質，還能轉運mRNA、miRNA和siRNA等多種RNA[19]，參與到蛋白質調節或靶基因調節，以此來實現再生修復作用。這也就導致了不同組織來源的MSCs雖然相似相似，但卻具有不完全相同的功能和潛力[20]，使得不同來源的MSC-Exo也不完全相同。

2.1 骨髓間充質干細胞來源的外泌體

骨髓間充質干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BM-BMSC)于1976年，Freidenstein首次發現，是人類最早發現的干細胞。具有強大的增殖能力和多向分化潛能，來源方便，易于分離培養，不存在免疫排斥等特性，因此成為組織工程最常用的種子細胞。

Gasado等[21]的研究中發現，骨髓間充質干細胞來源的外泌 體 (Bone marrow mesenchymal stem cells-derived Exosomes，BM-BMSC-Exo)可以抑制滑膜淋巴細胞增殖，降低腫瘤壞死因子-α表達水平，減輕滑膜炎的炎癥，由此看來BM-BMSC-Exo亦可作為OA“抗炎藥物”。但BM-BMSC-Exo不僅僅具有減輕炎癥反應的作用。Cosenza等[22]發現BM-BMSC-Exo主要是通過抑制軟骨細胞中金屬基質蛋白酶13(matrix metalloprotein 13，MMP13)、聚蛋白多糖酶 5(a disintegrin and metalloproteinase withthrombospondin motifs 5，ADAMTS5)和誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的產生，誘導Ⅱ型膠原蛋白(collagen Ⅱ，Col Ⅱ)和聚集蛋白聚糖(aggrecan-1,Agc1)的表達，同時抑制細胞凋亡和巨噬細胞活化。并且在膠原酶誘導的小鼠骨關節炎模型上證實BM-BMSC-Exo可促進軟骨修復、降低炎癥水平，延緩OA進程。與上述實驗相比，Liu等[23]通過實驗不僅發現BM-MSC-Exo可以增加Col Ⅱ和Agc1，減少MMP13和Runt相關轉錄因子2(RUNX2)，還發現BM-MSC-Exo可以通過lncRNAKLF3-AS1/miR-206/GIT1軸參與間充質干細胞介導的誘導軟骨細胞增殖以及抑制軟骨細胞凋亡。Qi等[24]發現BM-BMSC-Exo可以抑制p38和ERK的磷酸化并促進AKT的磷酸化，通過調控這幾個通路來抑制由IL-1β起的線粒體誘導的細胞凋亡，從而發揮治療OA的作用。

2.2 脂肪間充質干細胞

脂肪間充質干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cell，ADSC)最早是由Zuk等[25]人從抽脂術中脂肪組織懸液中分離培養出來的，是源于脂肪組織的成體干細胞，相較于其他MCS,ADSC可通過皮下抽吸等方法獲得，同時使用ADSC的倫理爭議也較少[26]。由于其極強的遷移能力和腫瘤趨向性，目前被廣泛應用于腫瘤領域的研究31。但由于其能耐受缺血、缺氧的軟骨微環境引起的細胞凋亡，在OA治療方面也能表現出較好的效果[27]。但也有研究表明ADSC可以產生抑制軟骨細胞增殖和刺激軟骨細胞凋亡的因子[28]。

Tofi?o-Vian等[29]研究發現脂肪間充質干細胞來源的外泌體(ADSC-Exo)通過抑制炎癥和氧化應激來介導OA成骨細胞的抗衰老作用。在體外IL-1β處理的炎癥模型中，ADSC-Exo通過抑制β-半乳糖苷酶活性，減少炎癥介質腫瘤壞死因子 -α(TNF-α)、白細胞介素 6(IL-6)、前列腺素E2(PGE2)和NO的產生，同時能顯著下調IL-1β誘導的線粒體膜電位變化和氧化應激，是細胞抗衰老機制的可能性之一。Ragni等[30]研究發現ADSC-Exo可抑制OA患者成纖維樣滑膜細胞中促炎性細胞因子和趨化因子的表達。

2.3 滑膜間充質干細胞

2001年De Bari首次從膝關節附近滑膜中分離出滑膜間充質干細胞 (synovium-derived mesenchymal stem cell，SMSC)，相較于其他MSC,SMSC具有更強體外增殖能力[31]，并且不受疾病、年齡等因素影響[32]，通常取自自體并且極易誘導分化，較少會發生免疫排斥反應等優點。這些優點使其在臨床研究中的地位逐日劇增，可作為軟骨損傷、骨損傷及韌帶損傷等組織工程中的種子細胞。

Zhu等[33]研究發現在膠原誘導的(collagenase-induced，CI)小鼠OA模型中，滑膜間充質干細胞來源的外泌體(SMSC-Exo)可以增強軟骨細胞的增殖和遷移，延緩OA進展，但不能使損傷軟骨恢復正常形態結構。Tao等[34]經實驗表明SMSC-Exo攜帶的Wnt5a和Wnt5b通過Wnt信號通路激活YAP，增強軟骨細胞的增殖和遷移，但同時會顯著減少細胞外基質(extracellular matrix,ECM)分泌。在此基礎上繼續實驗，利用轉染得到過表達miR-140-5p的SMSC-Exo可以彌補這一缺陷，其機制主要是通過RALA信號通路激活SRY-Box轉錄因子9(SRY-box transcription factor 9，SOX9)，避免抑制ECM的合成。過表達miR-140-5p的SMSC-Exo可以在不破壞細胞外基質分泌的情況下增強軟骨細胞的增殖和遷移，在大鼠模型中也得到了驗證。

2.4 胚胎干細胞/誘導型多能干細胞誘導的間充質干細胞

胚胎間充質干細胞是胚胎干細胞(embryonic stem cell，ESC)是早期胚胎或原始性腺中分離獲得的全能干細胞，擁有無限的自我更新能力以及多胚層分化能力，可誘導分化成幾乎所有種類和功能的細胞。但由于ESC存在倫理爭論、免疫抑制以及潛在的成瘤性等原因，限制了它在臨床上的應用。誘導型多能干細胞(Induced pluripotent stem cell,IPSC)由Shinya Yamanaka于2006年報道相關性研究，擁有與ESC相似的胚胎干細胞特性，并且不受倫理限制，使得其逐漸代替ESC成為研究熱點之一。由于其成瘤性，臨床常用ESC/IPSC向MSC轉化作為臨床干細胞治療的來源[35]。ESC/IPSCMSC細胞擁有與BM-BMSC類似的免疫調節功能以及多向分化能力，同時無成瘤性，使得其在再生醫學中潛力無限。

Wang等[36]研究發現hESC-MSC-Exo可以減輕軟骨破壞和基質降解，延緩OA 進展。分別用IL-1β處理的原代小鼠軟骨細胞作為體外OA模型以及DMM模型小鼠作為在體OA模型，從兩方面證明hESC-MSC-Exo可以使CollⅡ的合成增加，ADAMTS5合成抑制，以此來維持軟骨細胞表型，減輕軟骨損傷，延緩了OA進展。Zhang等[37]通過軟骨缺損大鼠模型表明hESC-MSC-Exo在修復臨界大小(直徑1.5mm，深度1mm)的軟骨缺損是有效的。經過12周，hESC-MSCExo組無論在形態學或是組織學上均優于對照組。主要通過激活AKT和ERK信號轉導通路促進細胞增殖和遷移并且增加M2型抗炎性巨噬細胞的浸潤。Zhu[33]等在膠原誘導的小鼠OA模型中，比較IPSC-MSC和SMSC分泌的Exo用于OA的治療效果。實驗表明IPSC-MSC-Exo和SMSC-Exo均能緩解OA的進展，但在體外IPSC-MSC-Exo具有更強的促進軟骨細胞增殖和遷移能力的作用；小鼠OA模型中，IPSC-MSCExo組對軟骨的修復作用也優于SMSC-Exo組。所以相較于SMSC-Exo，IPSC-MSC-Exo可能具有更好的治療效果。

2.5 圍產期組織間充質干細胞

以上MSC在臨床研究應用較為常見，此外，圍產期組織來源的MSC也受到越來越多的關注，如人胎盤、臍帶、羊膜來源的MSC。

2.5.1 臍帶間充質干細胞

Yan等[38]研究表明臍帶間充質干細胞(Umbilical cord mesenchymal stem cell，UCMSC)來源的外泌體(UMSC-Exo)通過轉化生長因子-β1(TGF-β1)和Smad2/3信號通路的激活，促進軟骨細胞增殖、遷移和基質合成，同時抑制細胞凋亡。

2.5.2 羊水干細胞

Zavatti等[39]研究發現羊水干細胞(Amniotic fluid stem cell，AFCS)來源的外泌體(AFCS-Exo)在體外可誘導THP-1細胞轉變成M2型巨噬細胞，增強抗炎因子IL-10和TGF-β1的表達，減弱促炎因子IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α的表達。在碘乙酸誘導的OA大鼠模型中，AFCS-Exo通過促進M2型巨噬細胞極化修復軟骨損傷。

2.5.3 胎盤間充質干細胞

胎盤間充質干細胞(Placental tissue-derived MSC, PLA-MSC)成骨能力最好。蔣文捷等[40]提出PLA-MSC可能通過下調TNF-α、IL-1β及IL-6水平，抑制MMPs的分泌與鈣黏素11的表達，上調TGF-β水平，來減輕類風濕關節炎大鼠的關節炎癥與軟骨破壞。但是并未直接提出是PLA-MSC來源的Exo在起作用。

3 小結

綜上所述，不同來源的MSC-Exo治療OA已經被人們逐漸發現并驗證，除此之外，MSC-Exo含有大量的miRNAs，除了可以直接作用于靶基因或者靶蛋白外，還參與到多種信號通路傳導，如 SMAD、AKT、ERK等通路。更重要一點，部分miRNAs具有修飾作用，就如上述提到的過表達miR-140-5p的SMSC-Exo可以增強軟骨細胞的增殖和遷移并且不破壞細胞外基質分泌；Sun等[41]也發現過表達miR-320c的BMMSC-Exo可更高效地促進軟骨細胞增殖，抑制MMP13生成和增強 Sox9表達。

雖然現在有大量證據能表明MSC-Exo對于OA有確切療效，但是許多功能及作用機制尚未完全闡明。此外，除了之前提到的IPSC-MSC-Exo比SMSC-Exo對OA的治療效果更佳以外，幾乎沒有其他實驗研究不同來源的MSC-Exo哪種對于OA的療效最好。在今后的臨床研究中，除了進一步探索MSC-Exo在體內的確切機制，還應注意到MSC-Exo最佳提取培養條件、臨床療程及劑量、如何修飾以達到最優效果等等，以確保安全、有效，做到精準醫療。

MSC-Exo在各個領域都在飛速發展，并且還有巨大的發展空間，在骨科疾病的治療中占據著重要的地位。雖然目前治療策略仍停留在體外研究階段，在臨床應用方面還面臨著諸多問題，如生物安全性、道德倫理等。但相信在不久的將來，隨著研究進一步深入，MSC-Exo會為OA治療提供一個更安全、更方便、更經濟和更有效的治療方法。