環(huán)狀RNA：銀屑病研究治療的新希望

王亞杰，陳雪，嚴(yán)炯，王崢嶸，劉青，趙珩，魏躍鋼，施建新(通信作者*)

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029；2.東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，江蘇 南京 210002)

1 環(huán)狀RNA的背景

最初發(fā)現(xiàn)circRNA是在植物類病毒、酵母線粒體及乙型肝炎病毒中[1]，但是由于結(jié)構(gòu)特殊(結(jié)構(gòu)中不存在5′帽子結(jié)構(gòu)或3′聚(A)尾巴結(jié)構(gòu))，當(dāng)時(shí)的RNA測(cè)序技術(shù)及生物信息分析技術(shù)有限，環(huán)狀RNA一直被認(rèn)為是異常剪切后錯(cuò)誤拼接的副產(chǎn)物[2]。伴隨著高通量RNA測(cè)序(RNA-seq)技術(shù)和生物信息學(xué)分析的快速發(fā)展，在人組織中已經(jīng)檢測(cè)出數(shù)以萬計(jì)的circRNA[3]，因此在很多研究領(lǐng)域中，科學(xué)家們都發(fā)現(xiàn)其參與了多種疾病的發(fā)生及發(fā)展。

2 環(huán)狀RNA的類型及成環(huán)機(jī)制

circRNA根據(jù)來源可以分為四類：全外顯子型的circRNA、內(nèi)含子和外顯子組合的EIcircRNA、內(nèi)含子組成的套索型circRNA、由病毒RNA基因tRNA、rRNA、snRNA等環(huán)化產(chǎn)生的circRNA。不過就目前的情況來說，circRNA的成環(huán)機(jī)制有四種主流推測(cè)。第一種是依賴于剪切體進(jìn)行的索尾接環(huán)化，第二種是RNA結(jié)合蛋白(RBPs)調(diào)控的環(huán)化。第三種是內(nèi)含子逆轉(zhuǎn)互補(bǔ)配對(duì)驅(qū)動(dòng)的環(huán)化。第四種是前體基因剪接中內(nèi)含子去除或外環(huán)子的套索環(huán)化[4]。

3 環(huán)狀RNA的特點(diǎn)

circRNA大多數(shù)是由外顯子環(huán)化而成的，外顯子circRNA主要細(xì)胞質(zhì)或儲(chǔ)存于外泌體中，而較少部分內(nèi)含子和外顯子組合的EIcircRNA和內(nèi)含子circRNA則大多數(shù)存在于細(xì)胞核中[5]。目前研究表明circRNA有以下特點(diǎn):(1)高穩(wěn)定性：circRNA的結(jié)構(gòu)中沒有5′帽子結(jié)構(gòu)或3′聚(A)尾巴結(jié)構(gòu)，可抵抗RNA核酸外切酶或RNaseR降解，相比傳統(tǒng)的線性RNA穩(wěn)定性更高。(2)高特異性：主要體現(xiàn)在細(xì)胞類型特異性及發(fā)育不同階段的組織特異性。(3)高豐度性：circRNA廣泛存在于多種真核生物的體內(nèi)，并且表達(dá)豐度差異很大，甚至是其對(duì)應(yīng)的線性mRNA的10倍以上。(4)高保守性：在不同物種中高度保守[6]。

4 環(huán)狀RNA的生物學(xué)功能

大量研究發(fā)現(xiàn)，circRNA在腫瘤，皮膚病，心血管，精神分裂等疾病的發(fā)生和發(fā)展環(huán)節(jié)密切相關(guān)，并且還預(yù)測(cè)到在疾病診斷標(biāo)志物的潛力，但對(duì)其生物學(xué)功能的研究尚欠，目前較受認(rèn)可的生物學(xué)功能，歸類如下：

4.1 充當(dāng)miRNA海綿或ceRNA

首先人類普遍認(rèn)為：circRNA可以通過其miRNA反應(yīng)元件(MRE)作為microRNA(MiRNA)的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA，通過將miRNA從親本mRNA中隔離出來，競(jìng)爭(zhēng)性地與miRNA結(jié)合，從而緩解了miRNAs對(duì)其靶基因的抑制作用，最終提高靶基因的功能活性，從而在疾病調(diào)控中發(fā)揮重要作用[7]。QIAO等研究發(fā)現(xiàn)：在差異表達(dá)的circRNA中鑒定出4405個(gè)異常的circRNAs都有miRNAs結(jié)合位點(diǎn)，因此可以預(yù)測(cè)它們通過CERNA機(jī)制發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，在人和鼠腦組織中，存在著一類名為小腦變性相關(guān)蛋白1反義轉(zhuǎn)錄物的circRNA，包含74個(gè)miR-7結(jié)合位點(diǎn)，充當(dāng)miR-7a/b的海綿樣作用，對(duì)miR-7起負(fù)調(diào)控作用。若CDR1as過表達(dá)，則與miR-7結(jié)合，提升miR-7靶基因表達(dá)水平；如CDR1as表達(dá)受到抑制，則miR-7靶基因表達(dá)水平下降[9]。此外，一個(gè)環(huán)狀RNA不僅可以扮演同一個(gè)miRNA海綿的不同角色，還可以扮演多個(gè)不同的miRNA的相同角色，這與自身的某些特性不謀而合。

4.2 與RNA結(jié)合蛋白(RBPs)結(jié)合

環(huán)狀RNA與RNA結(jié)合蛋白(RBPs)的結(jié)合，是通過與某些蛋白競(jìng)爭(zhēng)性相互作用以及作為蛋白質(zhì)支架調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用，進(jìn)而抑制相應(yīng)功能蛋白的活性，從而發(fā)揮生物調(diào)控功能[10,11]。比如circFOXO3與CDK2和p21的相互作用，產(chǎn)生抑制CDK2功能并抑制G1細(xì)胞周期進(jìn)程的三元復(fù)合物，非但如此，它還可以調(diào)節(jié)抗衰老蛋白ID-1、轉(zhuǎn)錄因子E2F1、抗應(yīng)激蛋白FAK等，促進(jìn)這些因子參與細(xì)胞衰老過程以及在細(xì)胞質(zhì)中的保留[6]。

4.3 編碼翻譯蛋白

近年還發(fā)現(xiàn)部分circRNA可以編碼蛋白，由于circRNA缺乏5′的帽子結(jié)構(gòu)、3′末端的尾巴結(jié)構(gòu)，所以到目前為止，環(huán)狀RNA是以非帽近年依賴的方式來翻譯蛋白質(zhì)的，這種翻譯方式主要是通過內(nèi)部的核糖體進(jìn)入位點(diǎn)促進(jìn)核糖體與環(huán)狀RNA的結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的翻譯功能[6]。Perriman和Ares在大腸桿菌中構(gòu)建了一個(gè)環(huán)狀RNA，其包含GFP序列，它可以表達(dá)GFP。但從目前情況來看，有關(guān)circRNA的翻譯功能機(jī)制還有待進(jìn)一步研究[12]。

5 環(huán)狀RNA與銀屑病

銀屑病(psoriasis)是一種慢性炎癥性皮膚病，易于復(fù)發(fā)，病程較長(zhǎng)，臨床上以紅斑、白色鱗屑，半透明薄膜，點(diǎn)狀出血現(xiàn)象為主要表現(xiàn)。其皮損特征主要以角質(zhì)形成細(xì)胞(KCs)的異常增殖和角化，是由多基因背景下的T細(xì)胞介導(dǎo)的。參與的因素很多，如炎癥、免疫、細(xì)胞增殖和凋亡，以及神經(jīng)遞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。免疫因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可以促進(jìn)KCs的異常增殖，最終發(fā)展成了銀屑病。在發(fā)病時(shí)期可影響到患者的身心健康，讓患者承受很大的精神壓力，同時(shí)也伴隨多種嚴(yán)重的并發(fā)癥，比如心血管疾病、惡性腫瘤以及其他自身免疫性疾病等等，截止到目前，國內(nèi)外對(duì)它的病因及發(fā)病機(jī)理研究尚未完全清楚，但已經(jīng)了解到它是一種復(fù)雜的、多因素的疾病，受到遺傳、環(huán)境因素的影響。雖然已經(jīng)出現(xiàn)了一些治療手段，但只能對(duì)癥狀進(jìn)行緩解，所以很需要尋找一些具有高特異性及敏感性顯著的早期診斷生物標(biāo)志物以及新的治療手段。幸運(yùn)的是，許多研究表明銀屑病中存在著許多表達(dá)異常circRNA，并且調(diào)控著銀屑病的發(fā)生發(fā)展，再加上circRNA具有高特異性和高穩(wěn)定性的特點(diǎn)，都表明了circRNA在不久的將來有機(jī)會(huì)成為一種新的診斷生物標(biāo)志物及新的治療靶點(diǎn)。

5.1 促進(jìn)銀屑病發(fā)生發(fā)展的環(huán)狀RNA

銀屑病可在患者的皮損部位、血液中、毛細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中表現(xiàn)出特異的miRNA表達(dá)，參與到皮膚組織的發(fā)育和再生，并通過分泌細(xì)胞因子對(duì)皮膚微環(huán)境產(chǎn)生重要影響。此外，銀屑病的主要病理特征是表皮細(xì)胞異常增殖，真皮內(nèi)T細(xì)胞介導(dǎo)的擴(kuò)張和炎癥反應(yīng)，真皮乳頭血管扭曲。在銀屑病中，發(fā)現(xiàn)有一部分circRNA參與調(diào)節(jié)炎癥、免疫和細(xì)胞增殖等等，而銀屑病的發(fā)生與發(fā)展正是與這些因素息息相關(guān)。然而，目前對(duì)circRNAs在銀屑病中的作用知之甚少。QIAO等研究發(fā)現(xiàn)：共鑒定出4956個(gè)環(huán)狀RNA在銀屑病中有差異表達(dá)，其中上調(diào)的有3016個(gè)，下調(diào)的有1940個(gè)；此外，與正常健康皮膚組織相比，銀屑病皮損中發(fā)現(xiàn)了1156個(gè)上調(diào)的mRNA和569個(gè)下調(diào)的mRNA，同時(shí)也在差異表達(dá)的circRNA中鑒定出4405個(gè)miRNA反應(yīng)元件，恰好證明了環(huán)狀RNA可以充當(dāng)miRNA的功能。其中HSA_CIRC_0061012在銀屑病患者的皮損中表達(dá)上調(diào)最為明顯，該環(huán)狀RNA包含的前五位對(duì)應(yīng)miRNA反應(yīng)元件分別是hsa_miR_7157_5p、hsa_miR_miR_4769_3p、hsa_miR_6817_5p、hsa_miR_4310以 及 hsa_miR_6882_3p[8]。經(jīng)過GO分析這5種miRNAs的靶基因，得知GO富集的前30位中的大多數(shù)與銀屑病有關(guān)，例如T細(xì)胞的選擇，對(duì)白細(xì)胞介素4的反應(yīng)，以及NF_κB轉(zhuǎn)運(yùn)到核內(nèi)的調(diào)節(jié)[8,11,13-15]。輔助性T淋巴細(xì)胞1(T helper lymphocytes 1，Th1)/Th2平衡向Th1顯性免疫的轉(zhuǎn)變是銀屑病發(fā)病的重要環(huán)節(jié)，IL-4可逆轉(zhuǎn)銀屑病Th1/Th2平衡紊亂。NF-κB作為轉(zhuǎn)錄因子，被視為銀屑病炎癥和免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng)的“調(diào)控閥門”[14]。提示circ0061012的異常表達(dá)可能通過上述方式參與了銀屑病的發(fā)病機(jī)制，因而可推測(cè)hsa_circ_0061012很有可能成為銀屑病新的生物標(biāo)志物，為銀屑病的診療提供了一個(gè)新的視角，也為進(jìn)一步深入研究銀屑病奠定了基礎(chǔ)。

5.2 抑制銀屑病發(fā)生發(fā)展的環(huán)狀RNA

在銀屑病中還同樣存在著可以抑制銀屑病發(fā)生發(fā)展的circRNA，有研究發(fā)現(xiàn)CIRC_0003738成為miR-562的分子海綿，釋放靶基因IL-17RA(IL-17受體A)的抑制作用，從而促進(jìn)銀屑病樹突狀細(xì)胞的IL-17A信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。同時(shí)，CIRC_0003738還可作為miR-490-5p的海綿，解除對(duì)靶基因IFNGR2的抑制，從而促進(jìn)銀屑病樹突起干擾素-γ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。circRNAs可能是miRNA活性的有效抑制劑，所以上調(diào)的CIRC_0003738通過miR-562/IL17RA和miR-490-5p/IFN-g受體2軸抑制銀屑病Tres的功能[16]。

在這項(xiàng)研究中，YANG等研究人員通過分析circRNA在銀屑病Tres中的表達(dá)譜，并與正常Tres進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)CIRC_0003738在銀屑病Tres中表達(dá)上調(diào)。CIRC_0003738基因敲除銀屑病患者皮損后，可通過抑制IL-17A和干擾素-g的產(chǎn)生，部分恢復(fù)銀屑病患者的抑制功能。此外，我們還發(fā)現(xiàn)CIRC_0003738的靶點(diǎn)為miR-562和miR-490-5p，分別靶向IL-17受體A(IL17RA)和干擾素-γ受體2(IFNGR2)。我們的發(fā)現(xiàn)確立了circRNAs在調(diào)節(jié)銀屑病Treg抑制功能中的新作用。CIRC_0003738可能是治療銀屑病的潛在靶點(diǎn)[3,17,18]。

YANG等研究人員對(duì)CIRC_0003738在正常樹突和銀屑病患者樹突中的表達(dá)模式進(jìn)行了環(huán)形微陣列分析，分析顯示，在銀屑病Tregs中發(fā)現(xiàn)了4個(gè)上調(diào)的circRNA和4個(gè)下調(diào)的circRNA，這些上調(diào)的circRNA可能參與炎癥相關(guān)通路，如磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-Akt信號(hào)通路、AMPK通路和泛素介導(dǎo)的蛋白水解。CIRC_0003738的異常上調(diào)可能通過促進(jìn)Th1和Th17相關(guān)的促炎細(xì)胞因子IL-17A和IFN-γ的分泌而降低銀屑病Tres的抑制功能。Cic_0003738與miR-562和miR-490-5p結(jié)合，circRNA最重要的作用是作為海綿隔離miRNA，miR-562和miR-4905p可能是Tregs中CIRC_0003738的靶點(diǎn)。這些結(jié)果表明IL-17RA是miR-562的直接靶點(diǎn)，IFNGR2是miR-490-5p的直接靶點(diǎn)。CIRC_0003738通過與miR-562競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，正向調(diào)節(jié)IL-17A的產(chǎn)生和IL-17信號(hào)；通過與miR-490-5p的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，調(diào)節(jié)IFN-g的產(chǎn)生和IFN-g信號(hào)。HAS_CIRC_0003738在銀屑病樹突中的表達(dá)上調(diào)可能會(huì)削弱其抑制功能。我們還發(fā)現(xiàn)，CIRC_0003738作為miR-562和miR-4905p的海綿，釋放了miR-562介導(dǎo)的IL-17A信號(hào)抑制和miR-490-5p介導(dǎo)的干擾素-γ信號(hào)抑制[19,20,21]。

因此，CIRC_0003738/miR-562和miR-490-5p軸有利于Tregs向Th1型和Th17型Tregs的轉(zhuǎn)化，這可能是銀屑病Tregs抑制功能降低的原因之一。Tregs抑制功能障礙在T細(xì)胞免疫失衡和銀屑病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)CIRC_0003738表達(dá)上調(diào)可能是銀屑病中Treg抑制功能降低的另一個(gè)機(jī)制。然而，還需要進(jìn)一步的研究來闡明其他circRNA在疾病發(fā)病機(jī)制中調(diào)節(jié)Treg功能的作用。除已報(bào)道的IL-23等細(xì)胞因子外，CIRC_0003738還可促進(jìn)銀屑病患者T細(xì)胞分泌IL-17A和IFN-γ，促進(jìn)炎癥過程，干擾T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。一種可能是HAS_CIRC_0003738可以促進(jìn)Th1型和Th17型細(xì)胞的分化，導(dǎo)致干擾素-γ和IL-17A的表達(dá)增加。一方面，TargetScan預(yù)測(cè)影響Th17細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子和輔助因子，包括RORA、RUNX1和MINA，將成為miR-562的靶基因。另一方面，Th1細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子T-bet的輔助因子Ets-1被預(yù)測(cè)為miR-490-5p的潛在靶基因。另一種可能的機(jī)制是HAS_CIRC_0003738的兩個(gè)靶點(diǎn)miR-490-5p或miR-562可能直接與IFN-g或IL-17A的30UTR結(jié)合，從而抑制其翻譯。也就是說，circRNA，如CIRC_0003738，可能通過刺激Tregs向Th1樣和Th17樣Tregs的轉(zhuǎn)化來抑制Tregs的抑制功能。通過這種機(jī)制，circRNAs可以調(diào)節(jié)銀屑病中Tregs功能受損[22-24]。

5.3 激活信號(hào)通路的銀屑病相關(guān)環(huán)狀RNA

circRNAs主要通過與miRNA結(jié)合參與miRNA的吸附，從而解除miRNA靶向抑制，導(dǎo)致靶基因上調(diào)。此外，我們根據(jù)起源于銀屑病相關(guān)MAP3K4的染色體位點(diǎn)鑒定了上調(diào)的circRNA。上調(diào)的circRNA可能通過結(jié)合相關(guān)的miRNAs來促進(jìn)MAP3K4的靶向表達(dá)。MAPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、對(duì)環(huán)境應(yīng)激的適應(yīng)、炎癥反應(yīng)和其他重要的細(xì)胞生理/病理過程以及銀屑病的發(fā)病機(jī)制。先前的研究報(bào)道銀屑病皮損表皮中的整合素上調(diào)并誘導(dǎo)多種MAPK通路，導(dǎo)致細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的異常產(chǎn)生。因此，我們推測(cè)circRNA可能參與了MAPK相關(guān)銀屑病的發(fā)病機(jī)制[25]。

6 小結(jié)

環(huán)狀RNA從一開始被人看做異常剪切后錯(cuò)誤拼接的副產(chǎn)物，到今日成為很多醫(yī)學(xué)疾病領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，尤其是在皮膚病中發(fā)揮了重大的作用并引起了相關(guān)研究人員的關(guān)注。目前的研究存在嚴(yán)重的趨同現(xiàn)象，大部分的功能機(jī)制聚焦在競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA模型，大部分的功能機(jī)制圍繞細(xì)胞增殖，遷移侵襲，細(xì)胞凋亡，細(xì)胞周期等非常宏觀的表型。circRNA的生理病理功能和機(jī)制依然沒有非常深入的了解。環(huán)狀RNA表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平可與性別、皮損程度、疾病分期等相關(guān)。但是這些推測(cè)仍然需要在更多的研究中得到證實(shí)。研究環(huán)狀RNA更重要的目的是為了早診斷，早治療。

目前針對(duì)銀屑病的治療主要包含口服、外用及生物制劑治療。銀屑病最讓人困擾的問題就是容易受環(huán)境、季節(jié)、飲食、感染、外傷等因素的影響，從而導(dǎo)致病情的復(fù)發(fā)或加重，而且銀屑病患者的生活質(zhì)量以及身心健康很容易受到影響，臨床上發(fā)現(xiàn)已經(jīng)有很多患者已經(jīng)患有抑郁癥。部分患者因?yàn)樽员啊⑵缫暋悩友酃獾仍颍苌賲⑴c社交活動(dòng)。所以尋求治療銀屑病的新方式也是重中之重。目前已經(jīng)有一些環(huán)狀RNA被發(fā)現(xiàn)研究者發(fā)現(xiàn)可以預(yù)測(cè)銀屑病復(fù)發(fā)，從而改善耐藥性。但是環(huán)狀RNA的研究還是處于初步階段中，要想運(yùn)用到臨床中，仍需要大量的實(shí)驗(yàn)、時(shí)間來進(jìn)行驗(yàn)證。

7 展望

環(huán)狀RNA的發(fā)現(xiàn)讓很多臨床醫(yī)生、研究者、和銀屑病患者重新燃起了希望，為銀屑病的臨床治療提供了新的思路和視角。雖然現(xiàn)在對(duì)環(huán)狀RNA的研究還不夠徹底，隨著科技的快速發(fā)展以及科學(xué)家的不懈努力，在不久的將來環(huán)狀RNA這團(tuán)迷霧最終會(huì)被撥開，未來可期。