探討高效液相色譜法測定硫酸伏拉帕沙原料藥中雜質

趙云鶴，商麗麗，吳迪，張偉一

(1.吉林省白城市食品藥品檢驗所，吉林 白城 137000；2.國家能源集團吉林龍華熱電股份有限公司白城熱電廠，吉林白城 137000)

0 引言

對于硫酸伏拉帕沙來講，一般是應用于有心臟病的患者以及下肢動脈栓塞的患者，以此降低動脈粥樣硬化現象的發生。相關人員應用頂空氣相色譜法對該項原料藥內包含的七種有機溶液殘留量展開了合理分析，采取HPLC 檢驗片劑的溶出度，其中，原料藥物質性能決定了藥品安全性和整體效果的體現，加強藥物雜質控制力度是確保藥品用藥安全性的關鍵所在。本文主要遵循質量源于設計方面的基本理念，將合成和降解反應機制當成一項基本導向，專門探究了生產期間的雜質情況，將雜質HPLC 檢測方式應用于硫酸伏拉帕沙原料藥內，經過應用該項可以看出，HPLC 檢測方式有著靈活性高的特征，可以快速定量以及定性分析硫酸伏拉帕沙包含的各項雜質，將該項雜質控制在合理范圍中，從一定程度上確保硫酸伏拉帕沙原料和制劑藥物的整體質量。

1 高效液相色譜法

高效液相色譜法主要是指以高壓液體為流動性的液相色譜分析法，該種方式是從上個世紀70 年代初形成的一種新型色譜分離分析技術，本身有著選擇性良好、靈敏程度提高、分析速度快、適用范圍廣等一系列特征，比較適合應用在高沸點、不穩定有機及生化試樣的分離分析環節中、采取高壓泵將有著一定極性的單一溶液或者是不同比例的混合溶液泵裝到填充劑的色譜柱內、被流動相帶入色譜柱內加以分離，然后進入檢測器，借助記錄儀或者數據處理系統記錄色譜信號，分析數據獲取準確的分析結果，按照固定相的不同可以將高效液相色譜法分為多方面，分別是液色譜法和液固色色譜法。從實際情況來看，高效液相色譜法是在氣相色譜和經典液相色譜的基礎上形成的現代液相色譜，和經典液相色譜沒有明顯的區別，不同點是現代液相色譜和經典液相色譜相比較來看效率極高，能夠達到自動化操作的目的，高效液相色譜的原理與經典液相色譜是相同的，不過它采用了高效色譜柱高壓輸液泵以及靈敏度的檢測器等，因此可以進一步提升高效液相色譜的分離效率分析速度以及靈敏度，在借助計算機技術的基礎上逐漸發展成為了自動化和智能化的現代分析儀器，雖然氣相色譜法是一項較好的分離和分析方式，有著分析速度快和分離效能好的特征，然而從實際情況來看，氣相色譜法只可以分析處于操作溫度下可以氣化而不分解的物質。高效液相色譜法是在經典色譜法的基礎上引用了氣相色譜的理論，在技術上將流動相改為高壓輸送，其中，最高輸送壓力可達29.4MPa，色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效遠遠高于經典液相色譜，每米塔板數可達幾萬或幾十萬，并且柱后連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進行連續檢測。特點：其一，高壓：液相色譜法以液體為流動相，將其稱為載液，液體流經色譜柱，受到阻力較大，為了可以快速通過色譜柱，需要對載液施加高壓。一般情況下，可以達150~350×105Pa。其二，高速：流動相在柱內的流速和經典色譜相比較來看要快很多，通常可達1~10mL/min。高效液相色譜法所需的分析時間遠遠少于經典液相色譜法少得多。其三，高效：HPLC 的分離效率遠遠高于普通液相色譜，在發展過程中又形成了許多新型固定相，促使分離效率全面提高。其四，高靈敏度：高效液相色譜目前廣泛采用高靈敏度的檢測器，進一步提升了分析的靈敏度，比如熒光檢測器靈敏度可達10-11g。與此同時，用樣量小。其五，適應范圍普遍且廣泛，氣相色譜法與高效液相色譜法的比較得出，氣相色譜法本身有著分離能力好，靈敏度高，分析速度快，操作便利等一系列特征，可是因為受技術條件的限制，沸點太高的物質或熱穩定性差的物質都無法應用氣相色譜法進行分析。而高效液相色譜法只要求試樣能制成溶液，根本不需要氣化，因此不受試樣揮發性的限制。對于高沸點、熱穩定性差、相對分子量大的有機物原則上都能夠采取高效液相色譜法來進行分離、分析。據統計表明，在已知化合物中，用液相色譜分析的約占70%~80%。

2 實驗環節

2.1 采取的儀器、試劑和相關材料

2.2 溶液制備

供試品溶液，稱取硫酸伏拉帕沙對照品，準確稱定，添加溶液，同時定量稀釋制成大約0.5mg/mL 的硫酸伏拉帕沙溶液。選取的對照溶液為精密量取供試品溶液1.0mL 于100mL量瓶內，使用溶液稀釋到刻度為止。系統適用性溶液；取各項雜質和適量的硫酸伏拉帕沙對照品，使用溶劑進行溶解，同時定量稀釋為1mL 的含硫酸伏拉帕沙大約0.5mg。

3 獲取的結果

3.1 系統適用性實驗

取出適量的雜質使用溶劑溶解并且定量稀釋制成含各雜質的溶液，將其當成一項雜質混合溶液。各項雜質之間的分離度均大于1.5，伏拉帕沙和相鄰雜質峰之間的分離度遠遠高于1.5。

3.2 考察線性關系

取出適量的雜質，進行精密稱定，添加50%比例的乙腈溶解到稀釋制成大約0.5mg/mL 的溶液，精密量取雜質0.4mL和其他各雜質相互放置于50mL 的量瓶內，

3.3 線性關系考察

取各雜質適量，精密稱定，加50%乙腈溶解并稀釋制成約0.5mg/mL 的溶液，精密量取雜質D0.4mL 與其余各雜質各1.0mL 置同一50mL 量瓶中，用溶劑稀釋至刻度作為儲備液，精密量取儲備液0.2、0.5mL，分別置20mL 量瓶中，加溶劑稀釋至刻度作為各線性溶液。雜質A、雜質B、雜質C、雜質D、雜質E、雜質G，均不在0.9~1.1 之間。

3.4 定量限和檢測限

取系列標準溶液，逐級稀釋，當S/N=10 時，即為定量限；當S/N=3 時，即為檢測限。

3.5 精密度實驗

對于不同的實驗人員來講，在不同時間采取不同的儀器重復測定供試品。舉例說明，在12 份供試品中，雜質A,E,G的檢出量均為0.01%，雜質B 均為0.10%，雜質C,D,F 及異構體雜質D,E,F 均沒有檢出，總雜質為0.16%，精密度良好。

3.6 溶液穩定性

處于良好的常溫狀態放置24h，與0h 相比較來看，供試品溶液雜質檢出量基本沒有發生任何的變化變化，對照溶液峰面積RSD 為0.70%(規定＜2.0%)。供試品溶液與對照溶液24h 內穩定。

3.7 回收率

按照實驗方法，測定9 份樣品的雜質A,B,C,D,E,F,G 和異構體雜質D,E,F 的回收率依次為100.3%、8.4%、102.2%、100.6%、97.6%范圍內，RSD 最大為3.2%(＜10.0%)使用該項方式產生的優勢極高。

按2～2.5米分廂，以便于田間管理為度，將畦面整平。如畦面不平易造成播種深度和田間水層不均衡，影響種子出苗生長。

3.8 耐用性體現

將檢測色譜條件分別展開適當的變動，比如乙腈初始比例25%+2%、柱溫30C+5C、水相中含磷酸量(0.1%+0.02%)基于合理條件下來看，分離度和標準要求相一致，樣品雜質個數和含量沒有發生明顯的改變，這從一定程度上體現出了良好的耐用性。

3.9 檢驗樣品

當前階段，對不同批號樣品進行詳細測定，雜質和異構體雜質沒有檢出。通過采用二極管陣列檢測器檢測各成分的吸收曲線，清楚的了解到了各雜質在260nm 波長處均存在著最大吸收和良好的靈敏度，因此，可以選擇260nm 當成一項檢測波長。對于流動相中的緩沖鹽體系，全面比較0.1%三氟乙酸溶液、0.05%溶液等，各項雜質之間的分離度不符合規定，在pH2.5PBS 溶液條件下，各雜質有著良好的分離度。

4 相關要點

4.1 明確色譜條件

當前階段，創建色譜條件的重點在于專屬色，一般情況下，采取在被測物對照品中添加相應比例的雜質以及輔料，以此檢驗選擇的色譜條件是否可以有效分離各項雜質以及被測物，依照1%比例的被測物濃度各雜質量添加到被測物內，對被測物內存在的雜質情況進行模擬，也就是說，存在著少量雜質的情況下，能夠和被檢測物達到有效分離，從而檢驗系統自身性能，最終將被測物的實際情況清楚以及客觀的體現出來。

4.2 選取檢驗波長

雜質是物質檢測的一項主要對象，而非檢測物，不過在測定工作實施期間，主要是根據峰面積加以表達，因此在選擇波長期間，必須綜合性考慮被檢測物和各項雜質基于檢驗波長的基礎上校正因子是否相同，需要配置相應濃度的被測物和各雜質溶液，采取紫外掃描的方式以吸光度相近的波長當成檢驗波長，在該項檢驗波長的基礎上分別實施相關檢測工作，各峰面積計算出校正因子，舉例說明，在f 為0.8~1.2 的情況下，說明被檢測物和各項雜質的F 相同。通常情況下，將被測物的最大吸收波長當成檢測波長，不加校正因子的計算方式，而沒有綜合考慮各項雜質F。

4.3 確定供試品溶液濃度

對于供試品溶液濃度的檢驗也有著極為關鍵的作用，雖然濃度較高的情況下可以將被測物雜質存在現象有效體現出來，不過一旦設置太高的話，將會形成嚴峻的主峰拖尾問題，形成檢測器超載等不良情況。而設置較低的時候，靈敏度不足，難以有效對雜質和含量變化加以檢驗。

4.4 線性實驗

一般來講，對雜質設定是該項雜質的100%濃度，線性驗證范圍10%~150%，也就是說，被測物測定濃度的1.0%-1.5%，而且精密度實驗和標準要求相符合，依照實際情況適當放寬到5.0%。

4.5 加樣回收率試驗

對于回收率試驗來講，主要是應用基于已知雜質含量的被測物內添加相應定量雜質的方式加以評價，把各項雜質以1%的濃度添加到被測物溶液內，檢驗采取的色譜條件能否分離檢測雜質以及被測物品中存在的雜質是否累加等，了解到測量加量的準確性。

4.6 強力破壞試驗

實施強力破壞試驗的主要目的是為了體現出原料藥的內在穩定性，是基于研究背景下非常重要的一方面，該項試驗是從比加速試驗劇烈條件下實施，其中涉及到了樣品在銷售以及運行期間存在的復雜聚類現象，從而檢測劇烈條件中形成的雜質。

4.7 確定其他色譜參數

其一，選擇流速，主峰保留時間為10min 以后。其二，選擇溶劑。通常選流動相作溶液，在流動相溶解性不佳的情況下將甲醇當成溶液。其三，設定色譜圖記錄時間，需要將存在的全部雜質和經過強力破壞試驗形成的雜質，至主成分保留時間的幾倍為止。其四，設定積分參數。色譜峰峰面積大小是由斜率和峰寬兩方面參數加以決定，在斜率非常大的情況下，切線的傾斜角非常大，峰面積越小發的話，峰寬通常無可以遵循的規律。另外，最小峰面積是非常重要的一項參數，該項參數設定越大，雜質峰將不容易被積分檢驗出來，被測物雜質含量符合要求。

5 討論

5.1 二極管陳列檢測器應用價值的體現

DAD 檢測器是對色譜峰的實施紫外掃描工作，結合所得圖譜進行相關比較，有效評價峰純度。不過從實際應用現狀可以看出，該項檢測器功能有一定的局限性存在，只有在雜質紫外掃描圖譜與主成分紫外描圖譜有著一定差別的情況下，才可以體現出極高的辨別效果，發揮出應有的作用。

5.2 質量標準中的系統適用性試驗

以被測物濃度1%來驗證被測物峰最難分離的雜質，從而體現出即時試驗的專屬性。

5.3 自身對照法和歸一化法的區別分析

當前階段，將供試品溶液稀釋100 倍后，獲取的1%對照溶液主峰面積應為供試品溶液主峰面積的1/100，當兩者差別非常大的情況下，就從一定程度上說明了稀釋100 倍后主峰峰面積不呈線性，這就需要采用自身對照法，而獲取的測定數據相同時，可以將歸一化法應用于穩定性試驗中。不過在質量標準中仍建議擬定為自身對照法。

5.4 HPLC 法檢測藥品雜質的優缺點體現

HPLC 法主要是在反相色譜上對被測物進行精準檢測，產生的優勢良好，作用極高，不過需要正確認識到的一方面是，過于盲目、片面采用HPLC 法的做法是不可取的。只有將在正相色譜中檢測被測物的TLC 法全面結合到一起，有效分析以及比較，遵循取長補短的基本原則，才可以從中獲取準確程度高的雜質數據，以此更加清楚和客觀的體現出有關結果。

6 結語

從以上論述來看，本次操作采取的方式具備操作方便和性能良好的特征，可以用于原料藥中，結合雜質的控制，進而為硫酸伏拉帕沙質量標準的建立奠定堅實的基礎。