miR-556-3p通過靶基因SASH1調控子宮內膜癌細胞的活力、遷移和侵襲*

梁 磊，楊 波，吳園園，孫 莉

（中國人民解放軍聯勤保障部隊第九八〇醫院婦產科，河北石家莊 050082）

子宮內膜癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，全世界2018 年估計有38 萬例新病例，9 萬例死亡病例［1］。子宮內膜癌的5 年相對存活率約為82%，但在過去的幾十年中，子宮內膜癌的發病率和死亡率都有所增加，晚期子宮內膜癌仍缺乏有效的治療方法［2-3］。微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是小的非編碼RNA 分子，大約為22 個核苷酸，通過與相應mRNA 靶標的3′-非翻譯區（3′-untranslated region，3′UTR）結合，導致mRNA降解和翻譯抑制，從而對基因調節起重要的作用。miRNA 參與增殖、轉移、凋亡等多種生物學過程。先前的研究發現，差異表達的miRNA 如miR-135a［4］、miR-320a、miR-340-5p［5］和miR-27a-5p［6］可能與子宮內膜癌的進展有關。研究表明，miR-556-3p在食管癌組織中上調表達，過表達miR-556-3p 促進食管癌細胞的增殖和侵襲［7］。SASH1（SAM and SH3 domain-containing 1）在宮頸癌［8］和胃癌［9］組織中的表達下調，可作為宮頸癌和胃癌患者的獨立預后因素。miR-128 通過靶向下調SASH1 的表達促進了骨肉瘤細胞增殖，抑制了細胞凋亡［10］。但miR-556-3p和SASH1在子宮內膜癌組織中的表達及其對子宮內膜癌細胞活力、遷移和侵襲的影響，且二者是否存在靶向關系目前知之甚少。因此，本研究考察miR-556-3p 對子宮內膜癌細胞活力、遷移和侵襲的影響，以及對SASH1 的靶向調控，以期為子宮內膜癌靶向治療提供參考。

材料和方法

1 臨床組織標本

2015 年4 月～2017 年12 月在本院收集子宮內膜癌和癌旁組織35 例。所有子宮內膜癌樣品均從進行子宮切除術的患者中收集，其中，子宮內膜癌患者經病理學確診，且術前未接受過放、化療，術前3 個月內未進行過激素治療。此項研究獲得所有參與者的知情同意，醫院倫理委員會予以批準通過。每例樣本離體后，保存于液氮中，用于RT-qPCR分析。

2 細胞與主要試劑

子宮內膜癌Ishikawa 細胞購自ATCC。DMEM培養基和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）均購自Gibco；Lipofectamine 2000 和Trizol 試劑均購自Invit?rogen；MTT 和二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）均購自Sigma-Aldrich；cDNA 反轉錄試劑盒（Thermo Fisher Scientific）；RIPA 裂解緩沖液、兔抗SASH1 抗體、兔抗細胞周期蛋白D1（cyclin D1）抗體、兔抗p21 抗體、兔抗基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）抗體、兔抗基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）抗體和辣根過氧化物酶偶聯的II 抗均購自Abcam；增強型化學發光試劑購自Pierce；Dual-Luciferase Reporter As?say System購自Promega。

3 方法

3.1 細胞培養、分組與轉染 Ishikawa 細胞在DMEM 培養基中培養，該培養基含有10% FBS、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素。將子宮內膜癌細胞在37 ℃的含5%CO2的潮濕培養箱中培養。選取對數生長期的細胞用于實驗。將細胞分為anti-miR-556-3p 組（轉染anti-miR-556-3p）、anti-miR-NC 組（轉染陰性對照anti-miR-NC）、pcDNA-SASH1 組（轉染pcDNA-SASH1）、pcDNA 組（轉染陰性對照pcDNA 3.1）、miR-556-3p 組（轉染miR-556-3p）、miR-NC 組（轉染陰性對照miR-NC）、anti-miR-556-3p+si-NC 組（共轉染anti-miR-556-3p 和陰性對照si-NC）和antimiR-556-3p+si-SASH1 組（共轉染anti-miR-556-3p 和si-SASH1）。轉染時，使用胰蛋白酶消化并計數細胞。將Ishikawa 細胞以每孔2×105接種到6 孔板中，培養24 h。當細胞融合度達到80%時，根據制造商的說明，使用Lipofectamine 2000進行轉染。Ishikawa細胞在轉染培養基中于37℃、5% CO2環境中生長6 h，然后在新鮮培養基中培養以進行進一步的分析。anti-miR-556-3p、miR-556-3p、si-SASH1 和pcDNASASH1 及各自陰性對照anti-miR-NC、miR-NC、si-NC和pcDNA 3.1均獲自RiboBio。

3.2 RT-qPCR 檢測子宮內膜癌組織、癌旁組織和Ishikawa 細胞中miR-556-3p 和SASH1 mRNA 的 表達 使用TRIzol 試劑提取子宮內膜癌組織、癌旁組織或轉染后Ishikawa 細胞的總RNA；使用cDNA 反轉錄試劑盒，根據制造商的說明，將總RNA（1 μg）合成互補的cDNA 模板；使用RT-qPCR 測定miR-556-3p和SASH1 mRNA 的表達水平。U6 和GAPDH 用作內參照。miR-556-3p 的正向引物序列為5′-GGGGTG?TAAACATCCTCGACTG-3′，反向引物序列為5′-ATTGCGTGTCGTGGAGTCG-3′；U6的正向引物序列為5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物序列為5′-CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT-3′；SASH1 的正向引物序列為5′-CGGGAAAGCGT?CAAGTCGGA-3′，反向引物序列為5′-ATCTCCTTTCTTGAGCTTGAG-3′；GAPDH 的正向引物序列為5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′，反向引物序列為5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGT?GAT-3′。

3.3 MTT 法檢測Ishikawa 細胞的活力 將Ishikawa細胞的濃度調至1×108/L，并在96 孔板中培養24 h。按照細胞分組進行不同處理。24、48 和72 h 后，將20 μL MTT 試劑（5 g/L）添加到每個孔中，然后孵育2 h。用移液管棄去上清液，加入100 μL DMSO 并搖動15 min。用酶標儀測量490 nm處的吸光度（A）。

3.4 Transwell小室法檢測Ishikawa細胞的遷移和侵襲能力 將Matrigel 與無血清DMEM 培養基按1∶5的比例混勻，包被上腔室用于侵襲分析（Transwell 遷移分析時，上腔室未用Matrigel 包被）。將轉染的Ishikawa細胞重懸于無血清的DMEM培養基中，并以每孔3×104細胞的密度加入到Transwell 上腔室中。下腔室加入500 μL 補充有10% FBS 的DMEM 培養基作為化學引誘劑。溫育24 h 后，除去未侵襲/遷移的細胞，并對侵襲/遷移的細胞染色，并在顯微鏡下計數。

3.5 Western blot 檢測SASH1、cyclin D1、p21、MMP-2 和MMP-9 的蛋白表達 使用RIPA 裂解緩沖液從轉染的Ishikawa細胞中提取總蛋白。30 μg蛋白進行10% SDS-PAGE，并在120 V 下分離；然后將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜上，并使用含5%脫脂奶粉的Tris-HCl-Tween 緩沖鹽溶液（Tris buffered saline with Tween，TBST）在室溫下封閉1 h；不同的Ⅰ抗（抗SASH1、cyclin D1、p21、MMP-2 和MMP-9 抗體，稀釋度均為1∶1 000）于4℃與膜孵育過夜；將膜用TBST溶液洗滌3 次，然后將膜與II 抗（稀釋度為1∶5 000）在室溫下孵育1 h，然后用TBST 溶液洗滌3 次；在增強型化學發光試劑中對蛋白進行可視化。GAPDH被用內參照，測定SASH1、cyclin D1、p21、MMP-2 和MMP-9蛋白的表達水平。

3.6 StarBase 預測和雙螢光素酶報告基因實驗分析miR-556-3p 和SASH1 的靶向關系 使用StarBase（http：//starbase.sysu.edu.cn/）在線數據庫檢測miR-556-3p 的潛在靶標，發 現miR-556-3p 與SASH1 的3′UTR 存在部分互補配對的序列，并由RiboBio 合成。分別通過PCR擴增含有miR-556-3p假定結合位點的野生型（wild-type，WT）和突變型（mutant，MUT）SASH1 3′ UTR 片段，將擴增的片段插入到pmirGLO 雙螢光素酶表達載體中，以構建WT-SASH1和MUT-SASH1螢光素酶報告基因載體。將Ishikawa細胞以每孔5×104的濃度接種到24孔板中過夜；按照制造商的方案，使用Lipofectamine 2000 將細胞與WT-SASH1 或MUT-SASH1 和miR-NC 或miR-556-3p共轉染；48 h 后，使用Dual-Luciferase Reporter Assay System測定螢光素酶活性。

4 統計學處理

采用SPSS 22.0軟件進行數據的統計和分析，結果以均數±標準差（mean±SD）表示。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學顯著性。

結 果

1 miR-556-3p 和SASH1 在子宮內膜癌組織中的表達

RT-qPCR 和Western blot 檢測結果顯示，與癌旁組織比較，子宮內膜癌組織中miR-556-3p 表達量顯著增加，SASH1的mRNA 和蛋白表達量顯著減少（P＜0.05），見圖1。

2 抑制miR-556-3p 表達對子宮內膜癌Ishikawa 細胞活力、遷移和侵襲的影響

如圖2 所示，與anti-miR-NC 組比較，anti-miR-556-3p 組子宮內膜癌Ishikawa 細胞的miR-556-3p 表達量顯著減少，48 h和72 h的細胞活力顯著減弱，遷移細胞數和侵襲細胞數顯著減少，cyclin D1、MMP-2和MMP-9 蛋白水平顯著降低，p21 蛋白水平顯著升高（P＜0.05）。

3 SASH1 過表達對子宮內膜癌Ishikawa 細胞活力、遷移和侵襲的影響

如圖3 所示，與pcDNA 組比較，pcDNA-SASH1組子宮內膜癌Ishikawa 細胞中SASH1 蛋白表達量顯著增加，48 h和72 h的細胞活力顯著減弱，遷移細胞數和侵襲細胞數顯著減少，cyclin D1、MMP-2 和MMP-9 蛋白水平顯著降低，p21 蛋白水平顯著升高（P＜0.05）。

Figure 1.Expression of miR-556-3p and SASH1 in endometrial cancer tissues.A：the expression of miR-556-3p in endometrial can?cer tissues；B：the mRNA expression of SASH1 in endometrial cancer tissues；C：the protein expression of SASH1 in endo?metrial cancer tissues（N：normal；T：tumor）.Mean±SD. n=35.*P＜0.05 vs normal tissues.圖1 miR-556-3p和SASH1在子宮內膜癌組織中的表達

4 miR-556-3p靶向調控SASH1的表達

StarBase 預測結果顯示，SASH1 的3′UTR 部分核苷酸序列可與miR-556-3p 形成互補配對，見圖4A。雙螢光素酶報告基因實驗結果顯示，與miRNC 組比較，miR-556-3p 組轉染WT-SASH1 的細胞螢光素酶活性顯著降低（P＜0.05），而轉染MUT-SASH1的細胞螢光素酶活性無顯著變化（P＞0.05），見圖4B。Western blot 檢測結果顯示，與miR-NC 組比較，miR-556-3p組細胞中SASH1蛋白的表達量顯著減少（P＜0.05）；與anti-miR-NC 組比較，anti-miR-556-3p組細胞中SASH1蛋白的表達量顯著增加（P＜0.05）。

5 敲減SASH1表達逆轉了抑制miR-556-3p表達對子宮內膜癌Ishikawa細胞活力、遷移和侵襲的作用

如圖5 所示，與anti-miR-NC 組比較，anti-miR-556-3p 組子宮內膜癌Ishikawa 細胞的SASH1 蛋白表達量顯著增加，24 h、48 h 和72 h 的細胞活力顯著減弱，遷移細胞數和侵襲細胞數顯著減少，cyclin D1、MMP-2 和MMP-9 蛋白水平顯著降低，p21 蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與anti-miR-556-3p+si-NC 組比較，anti-miR-556-3p+si-SASH1 組細胞中SASH1 蛋白水平顯著降低，24 h、48 h、72 h 的細胞活力顯著增強，遷移細胞數和侵襲細胞數顯著增多，cyclin D1、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達量顯著增加，p21 蛋白表達量顯著減少（P＜0.05）。

討 論

由于發生率高，子宮內膜癌的臨床治療已引起越來越多的關注［11］。現階段，在治療該疾病方面已經取得突破，大多數患者在手術、放療和化療后獲得了可喜的預后。然而，由于不及時或不適當的治療，某些患者也可能發生腫瘤轉移，嚴重影響了患者的預后［12］。因此，確定子宮內膜癌增殖和轉移的關鍵分子機制將有助于為患者制定更好的治療策略。癌細胞的增殖、遷移和侵襲是一個多步驟、多因素的生物學過程。越來越多的證據表明，miRNA 表達在腫瘤發生和發展中起著至關重要的作用，miRNA 通過調節腫瘤細胞的增殖、遷移、凋亡和血管生成等影響多種腫瘤的病理演進過程，包括子宮內膜癌［13-15］。本研究鑒定了子宮內膜癌中miR-556-3p水平及其促進細胞活力、遷移和侵襲作用，此外，還將SASH1（子宮內膜癌的一種可能的腫瘤抑制因子）確定為miR-556-3p 的直接功能靶標，這一發現將為子宮內膜癌患者治療方法的改進提供新的依據。

Figure 2.The effect of miR-556-3p expression knock-down on the viability，migration and invasion of endometrial cancer Ishikawa cells.A：the change of miR-556-3p expression level after transfection with anti-miR-556-3p；B：the change of cell viabili?ty after transfection with anti-miR-556-3p；C：the changes of migration and invasion abilities after transfection with antimiR-556-3p（scale bar=200 μm）；D：the changes of cyclin D1，p21，MMP-2 and MMP-9 protein expression after transfec?tion with anti-miR-556-3p.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs anti-miR-NC group.圖2 敲減miR-556-3p表達對子宮內膜癌Ishikawa細胞活力、遷移和侵襲的影響

在本研究中，RT-qPCR 檢測結果顯示，與癌旁組織相比，miR-556-3p 在子宮內膜癌組織中顯著上調，表明其參與子宮內膜癌的發生發展過程。已有一些研究報道了miR-556-3p 在腫瘤中的功能和意義。例如，miR-556-3p 是人類食管癌［7］和膀胱癌的促癌基因，在膀胱癌組織和細胞中表達上調，過表達miR-556-3p 促進膀胱癌細胞的增殖、遷移、侵襲和集落形成［16］。然而，關于miR-556-3p 在子宮內膜癌中的功能或分子機制了解甚少。本研究的功能實驗結果顯示，抑制miR-556-3p 表達顯著抑制子宮內膜癌Ishikawa 細胞的活力、遷移、侵襲及cyclin D1、MMP-2和MMP-9 蛋白表達，顯著提高p21 蛋白水平。這表明miR-556-3p 在子宮內膜癌中充當致癌因子，抑制miR-556-3p 具有抑制子宮內膜癌細胞活力、遷移和侵襲的功能，與前人研究一致。

SASH1基因包括22 個外顯子和21 個內含子，位于染色體位點6q24.3，長度為279 746 個堿基對。SASH1 是信號銜接蛋白SLY 家族的成員，編碼包含SAM 和SH3 結構域的蛋白質，是蛋白與蛋白相互作用所必需的，并介導信號復合物的形成［17］。在數種類型的腫瘤中，SASH1 被鑒定為一種有效的腫瘤抑制劑，如宮頸癌［8］、胃癌［9］和食管鱗狀細胞癌［17］。SASH1 在肝癌細胞中低表達，過表達SASH1 可以抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲［18］。這些研究表明，SASH1 在許多癌癥中起著抑癌作用。本研究中，子宮內膜癌組織中SASH1的mRNA 和蛋白表達顯著下調，SASH1 過表達后，子宮內膜癌Ishikawa 細胞的活力、遷移、侵襲及cyclin D1、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達顯著降低，p21 蛋白水平則顯著升高，提示SASH1在子宮內膜癌中同樣扮演著抑癌基因的角色，發揮一定的抗腫瘤作用，與前述報道［17-18］相同。

Figure 3.The effect of SASH1 over-expression on the viability，migration and invasion of endometrial cancer Ishikawa cells.A：the protein expression levels of SASH1，cyclin D1，p21，MMP-2 and MMP-9 after transfection with pcDNA-SASH1；B：the change of cell viability after transfection with pcDNA-SASH1；C：the changes of cell migration and invasion abilities after transfection with pcDNA-SASH1（scale bar=200 μm）.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs pcDNA group.圖3 SASH1過表達對子宮內膜癌Ishikawa細胞活力、遷移和侵襲的影響

miRNA 通過調節特定靶標的表達，在腫瘤的發展和進程中發揮抑癌或致癌作用［19］。資料顯示，宮頸鱗狀細胞癌中的SASH1 受hsa-miR-21 調控［19］；miR-17 通過靶向骨肉瘤細胞中的SASH1，促進細胞增殖和遷移，并抑制細胞凋亡［20］。已有證據表明，miR-556-3p 可以靶向DAB2IP 調控食管癌［7］和膀胱癌［16］的惡性進展；PPP2R2A 是miR-556-5p 促進前列腺癌細胞增殖的直接靶標［21］。由于并未發現miRNA對其下游靶基因的表達調控有細胞特異性，猜想這些靶基因可能在不同類型的細胞中均發揮作用。本研究為了確定miR-556-3p在子宮內膜癌中致癌作用的潛在靶標，利用生物信息學預測和雙螢光素酶報告基因實驗進行分析，結果顯示，SASH1是miR-556-3p 的下游靶基因。此外miR-556-3p 的上調或下調可降低或升高SASH1 的表達水平；抑制miR-556-3p表達對Ishikawa 細胞活力、遷移和侵襲的抑制作用可被干擾SASH1表達所逆轉。這些結果說明抑制miR-556-3p 表達通過下調靶基因SASH1的表達水平而發揮抑制子宮內膜癌細胞活力、遷移和侵襲的作用。

總之，miR-556-3p在子宮內膜癌中表達上調，抑制miR-556-3p 通過靶向SASH1抑制子宮內膜癌細胞的活力、侵襲和遷移。這為鑒定子宮內膜癌新的診斷和治療方法的進一步研究提供了基礎。

Figure 4.miR-556-3p targeted SASH1 and regulated its expression.A：the 3′UTR of SASH1 contained a nucleotide sequence com?plementary to miR-556-3p；B：dual-luciferase reporter experiment；C：miR-556-3p regulated the protein expression of SASH1.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs miR-NC group；#P＜0.05 vs anti-miR-NC group.圖4 miR-556-3p靶向調控SASH1的表達

Figure 5.Knock-down of SASH1 expression reversed the effect of miR-556-3p expression inhibition on the viability，migration and in?vasion of endometrial cancer Ishikawa cells.A：the protein levels of SASH1，cyclin D1，p21，MMP-2 and MMP-9 after transfection with anti-miR-556-3p and si-SASH1；B：the cell viability after transfection with anti-miR-556-3p and si-SASH1；C：the cell migration and invasion abilities after transfection with anti-miR-556-3p and si-SASH1（scale bar=200 μm）.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs anti-miR-NC group；#P＜0.05 vs anti-miR-556-3p+si-NC group.圖5 敲減SASH1表達逆轉了抑制miR-556-3p表達對子宮內膜癌Ishikawa細胞活力、遷移和侵襲的作用