丙酮酸乙酯通過Nrf2途徑抑制谷氨酸對大鼠小腦顆粒神經元的毒性作用*

歐陽穎，曾愛紅，張羚枚，周瑞瑜，唐淑敏，阮揚皓，李伍鳳

（中山大學孫逸仙紀念醫院兒科，廣東廣州 510120）

新生兒缺氧缺血性腦病（hypoxic-ischemic en?cephalopathy，HIE）是新生兒窒息后的嚴重并發癥，是引起智能落后、癲癇、共濟失調和腦性癱瘓［1］的主要原因之一。據報道，近10年來HIE的發病率大約在（2～3）/1 000 例活產新生兒［2-3］。到目前為止，國內外對新生兒缺氧缺血性腦病的治療，主要包括支持治療和對癥治療，但均對已有的腦損傷無作用。因此，尋找更為有效的治療方法成為當前急需解決的問題。

HIE 是圍產期新生兒缺氧、缺血引起的腦部病變，在大多數情況下，缺氧和缺血同時發生，但缺血對中樞神經系統損傷更大。缺氧缺血性腦病發病機理極為復雜，現階段普遍認為HIE 是代謝障礙、酸中毒、興奮性氨基酸的毒性作用、細胞內鈣超載、氧化應激反應、炎癥反應等一系列病理作用的結果［4-6］。因此，明確HIE 的發病機制、尋找高效且副作用少的治療方法具有重要的意義。

丙酮酸乙酯（ethyl pyruvate，EP）是丙酮酸的酯化物，是一種化學性能穩定、親脂性的小分子化合物，能迅速穿過細胞膜和線粒體［7］。EP 的主要藥理作用包括提供能量代謝物，保護細胞免受氧化產物和自由基的侵害，抑制炎癥反應［8-11］。有報道稱EP通過核因子E2 相關因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）/抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）/血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）通路激活內源性抗氧化系統［10］。此外，EP 還通過與P65［11］相互作用抑制NF-κB的活性，降低早期腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）等炎癥因子的表達，下調［12］晚期HMGB1的合成和釋放。因此，EP 有望通過逆轉HIE 的病理過程，發揮更大的神經保護作用。研究EP 作用下體外培養新生大鼠顆粒神經元Nrf2/ARE/HO-1 信號通路的激活狀態并探討其機制，將為HIE未來臨床治療提供參考資料。

材料和方法

1 主要試劑

基礎細胞培養液和新生小牛血清購自Gibco BRL；胰酶、脫氧核糖核酸酶、胰酶抑制劑、阿糖胞苷、核糖核酸酶、谷氨酸（glutamate，Glu）、多聚賴氨酸、二乙酸熒光素（fluorescein diacetate，FDA）、碘化丙 啶（propidium iodide，PI）、Hoechst 33258、EP 和MK-801 均購自Sigma；硫酸慶大霉素購自福建三明制藥廠；Triton X-100和氯仿購自Merck；飽和重蒸酚溶液購自中山大學醫學院藥理實驗室；細胞核蛋白與細胞質蛋白提取試劑盒購自寧波唯奧公司；H2-DCF-DA 購自Invitrogen；抗Nrf2 和HO-1 抗體購自Stressgen；MTT 購自Sigma-Aldrich；二氫乙啶（dihy?droethidium，DHE）和4%多聚甲醛購自Sigma。

2 小腦顆粒神經元培養

按文獻方法［13］，取新生7 d 的Sprague-Dawley（SD）大鼠，雌雄不拘，在無菌條件下斷頭、開顱，取小腦，放在解剖液［10×Krebs 緩沖液（NaCl 72.5 g，KCl 4.0 g，NaH2PO41.4 g，右旋糖26 g，苯酚紅100 mg，EP 59.6 g/L，pH 7.4）15 mL，白蛋白0.45 g，3.82%MgSO41.2 mL，pH 7.4］中，顯微鏡下去除血管和腦膜。然后用眼科剪剪成1 mm×1 mm×1 mm 大小的組織塊，胰酶（0.25 g/L）消化（37℃，15 min），立即加反應終止液I（含胰酶抑制劑0.52 g/L、DNase-I 0.08 mg/L和Mg2+3 mmol/L 的解剖液）混勻、離心、棄上層，沉淀加反應終止液II（含Mg2+3 mmol/L 和Ca2+100 μmol/L 的解剖液）2 mL 反復吹打，離心（319×g，30 s），去除未消化的組織，細胞懸液再離心（958×g，5 min），棄上層，細胞沉淀以完全培養液（BME，25 mmol/L KCl，谷氨酰胺20 mmol/L，10%胎牛血清，0.1 g/L 硫酸慶大霉素）分散，按（1.5～1.8）×109/L 種植在預先鋪有多聚賴氨酸（5 mg/L）的培養板或培養皿中，細胞數為（2～3）×106/cm2。然后置于CO2培養箱中（37℃，5% CO2）培養。24 h 后，加阿糖胞苷（終濃度為10 μmol/L）。7 d 后，加葡萄糖（終濃度為5 mmol/L）。以后每隔4 d 按前法加一次葡萄糖。7 d后，神經元分化成熟。

3 Glu興奮性模型建立與實驗分組

將體外培養7 d 的小腦顆粒神經元隨機分為：（1）空白對照（control）組；（2）Glu 組［參考文獻［13］，棄去培養液，加入Locke 溶液（含154 mmol/L NaCl，5.6 mmol/L KCl，3.6 mmol/L NaHCO3，2.3 mmol/L CaCl2，5.6 mmol/L glucose，10 mmol/L HEPES，pH 7.4）和1 mol/L 甘氨酸，以充分激活NMDA 敏感的Glu 識別位點，Glu 濃度為100 μmol/L，30 min 后換成普通的完全培養液］；（3）Glu+EP 組［在（2）組基礎上加入不同濃度（0.1、0.5、1、2.5 和5 mmol/L）的EP。每組有8個復孔。

4 主要方法

4.1 FDA/PI 熒光染色 用FDA 和PI 分別對活細胞和死細胞進行染色。將待處理的細胞，棄培養液后，以含糖的PBS 洗1 遍，加入FDA（10 mg/L）和PI（4 mg/L），于暗室37℃孵育5 min，棄染液后以含糖的PBS 洗2 遍，熒光顯微鏡下拍照，每組隨機選3 個視野拍照。與正常對照組比較，計算存活率。細胞存活率（%）=各處理組的活細胞數/正常對照組的活細胞數×100%。

4.2 MTT 實驗 取培養7 d 的小腦顆粒細胞，在給藥相應時間后，加入新鮮配制的MTT（溶于PBS，5 g/L）20 μL，將細胞置于含5%CO2、37℃的培養箱中孵育4～6 h后去除培養液，加入二甲基亞砜溶解結晶體，待結晶體完全溶解后，在酶標儀上（測定波長570 nm，參考波長630 nm）測吸光度（A），細胞存活率（%）=A處理組/A對照組×100%。

4.3 細胞內游離鈣濃度（intracellular free calcium concentration，［Ca2+］i）的測定 用培養第7 d 的細胞，經5 μmol/L的Fluo-3/AM負載60 min，用Hanks液洗滌3次，放在倒置熒光顯微鏡下，由自動灌洗儀持續灌流緩沖液。應用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細胞內Fluo-3 的熒光強度（激發波長488 nm，發射波長526 nm），每組選取20個活細胞，每個細胞間隔2 s掃描1 次，共掃描16 次，記錄16 個熒光強度數值，取平均值為該細胞的熒光強度。根據公式計算：［Ca2+］i=Kd（F?Fmin）/（Fmax?F），Kd為Fluo3 與Ca2+反應的解離常數，在室溫下為400 nmol/L；F 為實驗記錄到的熒光強度值；Fmax為最大熒光值，加入5 mmol/L CaCl2的EGTA 溶液所測得的值；Fmin為最小熒光值，由在無Ca2+緩沖液中加入10 mmol/L EGTA測得。

4.4 H2-DCF-DA 檢測 ROS 在Glu 模型作用后90 min，棄去培養液，使用PBS 清洗3 次后，加入終濃度為30 μmol/L 的H2-DCF-DA，在37℃培養箱中孵育20 min，用PBS清洗1次，迅速置于熒光酶標儀檢測熒光強度，激發及吸收波長采用475 nm/525 nm。

4.5 DHE 檢測超氧陰離子 在Glu 模型作用后90 min，棄去培養液，使用PBS 清洗3 次后，加入終濃度為10 μmol/L 的DHE，在37℃培養箱中孵育30 min，用PBS清洗1次，迅速置于多功能熒光酶標儀檢測熒光強度，激發及吸收波長采用485 nm/535 nm。

4.6 Western blot 根據試劑盒說明，提取細胞核蛋白與細胞質蛋白，于?80℃保存，后與DTT 混合、煮沸、離心，使蛋白質變性，取上清20 μL 于200 V 進行SDS-PAGE 45 min；取出硝酸纖維膜，浸入TBS+TBST+5%脫脂奶粉溶液，室溫封閉2 h，在10 mL I 抗稀釋液中把NC 膜和I抗共同輕搖孵育，4℃過夜。第2天，用1×TBST 洗NC 膜3次（每次15 mL，5 min），把NC 膜與溶解在10 mL 封閉液中的與HRP 結合的Ⅱ抗（適當比例稀釋）和HRP 結合的抗生物素抗體（1∶1 000）室溫下共同孵育1 h；用1×TBST 洗NC 膜3 次（每次15 mL，5 min），與10 mL 1× LumiGLO（含0.5 mL 20×底物B和9.0 mL水）室溫下輕搖1 min。排去過量的液體，在暗室中使其與X 光片在增感屏中緊密接觸，使X 光片感光數秒到數分鐘。顯影，定影，沖洗，晾干，拍照并進行計算機圖像分析。

4.7 免疫組化 細胞用PBS 溶液洗2 次，后用4%多聚甲醛固定在室溫下30 min。然后再用PBS 洗2次，通過0.5% Triton X-100 在室溫下孵化15 min。10%的細胞封鎖在山羊血清，室溫1 h。4℃孵育過夜。PBS 洗滌3 次，室溫下用稀釋的熒光抗體孵育1.5 h。室溫下用Hoechst 33258 染色細胞核15 min，PBS洗滌3次后，激光共聚焦顯微鏡成像。

4.8 ARE誘導轉錄活性檢測 用Promega公司雙螢光素酶報告基因試劑盒檢測熒光強度。所有的程序都是按照制造商的指示進行的。pGL6-ARE-Luc 質粒是基于pGL6 載體構建，ARE 序列為3 個串聯的CACCGTGACTCAGCAATT，并在我們的實驗中進行。誘導轉錄活性增加倍數=（藥物誘導的螢火蟲螢光素酶活性/藥物誘導的海腎螢光素酶活性）/（對照組誘導的螢火蟲螢光素酶活性/對照組誘導的海腎螢光素酶活性）。

5 統計學處理

用SPSS 16.0 統計軟件進行分析。以上實驗均重復3次，數據均采用均數±標準差（mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

3.3.1 加強電力需求側管理。在現有用戶負荷管理范圍內，選取部分可中斷負荷，建設毫秒級精準負荷控制系統，優化升級現有負荷管理系統。應用大數據平臺，試點對用戶用電行為開展實時分析，進一步挖掘其在用電預測、錯峰調度等方面潛力，促進供需互動。

結 果

1 EP對小腦顆粒神經元的保護作用

如圖1 所示，EP 對原代培養神經元Glu 興奮性毒性的抑制作用呈劑量依賴性。100 μmol/L Glu 對原代培養的小腦顆粒神經元有明顯的損傷作用，表現為細胞數量減少，細胞體積異常，軸突/樹突斷裂和消失。FDA/PI雙染色下可見正常組絕大部分細胞染成綠色，夾雜著少許紅染的細胞，Glu 組則綠染細胞減少，而紅色的死細胞明顯增多。1 mmol/L EP 預處理30 min 后，Glu 誘導損傷下存活神經元數量顯著增加（P＜0.05），EP以濃度依賴性的方式顯著提高了神經元的活力。

2 細胞內ROS檢測結果

我們通過H2-DCF-DA 檢測小腦顆粒神經元的ROS 含量，用DHE 檢測超氧陰離子含量。H2-DCFDA 染色后，含ROS 的細胞發綠色熒光，ROS 越多，熒光強度越大。與正常對照組少量的綠色熒光細胞相比，Glu 組可見到綠色熒光細胞明顯增多，熒光強度大；而Glu+EP 組則綠色熒光細胞明顯減少，熒光強度明顯減弱，見圖2。DHE 染色后，含超氧陰離子的細胞與DHE 作用而發出紅色熒光，超氧陰離子越多，熒光強度越大。與正常對照組少量紅色熒光細胞相比，Glu 組可見紅色熒光細胞明顯增多，熒光強度增大；而Glu+EP 組則紅色熒光細胞明顯減少，熒光強度較弱，見圖2。

3 小腦顆粒神經元［Ca2+］i檢測結果

我們通過Fluo-3 作為指標檢測細胞內Ca2+。在小腦顆粒神經元中，加入Glu，動態觀察［Ca2+］i水平，20 s 即可觀察到熒光強度迅速升高，達到高峰，隨時間延長逐漸降低，但6 min 時仍顯著高于正常；加入EP（2.5 和5.0 mmol/L）預處理30 min 可以部分阻滯［Ca2+］i升高（P＜0.05），見圖3。

4 EP通過激活Nrf2/ARE/HO-1通路發揮神經保護作用

通過檢測EP 處理神經元中Nrf-2 的表達，觀察到EP 組中細胞質Nrf2 表達下降，細胞核Nrf2 表達明顯上調，見圖4A。之后，在Nrf2 免疫組化染色后加入Hoechst 染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，正常對照組細胞漿染成紅色，核染成藍色，而EP 組中細胞質染成紅色，細胞核內因Nrf2明顯升高，核亦染成紅色，同時在Hoechst 染色后呈藍色，融合后核呈紅色，提示Nrf2 轉入核內，見圖4B。在檢測ARE 的轉錄活性實驗中，EP 組ARE 的轉錄活性顯著上調（P＜0.05），見圖4C。如圖4D 所示，Glu 或EP 處理3 h、6 h 和12 h 均顯著提高HO-1 的表達水平（P＜0.05），且Glu 和EP 共處理進一步增加了HO-1 的表達。相反，HO-1 抑制劑鋅原卟啉（zinc protoporphyrin，ZnPP）部分抑制了EP的神經保護作用，見圖4E。

討 論

1 Glu對體外培養小腦顆粒神經元的毒性作用

本實驗中，小腦顆粒神經元在Glu作用后24 h存活率為（28.4±2.1）%，與文獻結果相符［14］。DNA 電泳未出現梯形條帶，呈涂布狀，提示主要的死亡方式為壞死。另一研究［15］的結果則不同，在沒有甘氨酸存在及無鎂離子的Locke 液的情況下，Glu 的毒性濃度選擇為300 μmol/L，但細胞存活率仍高于本實驗模型。因此，同樣為Glu模型，濃度不同，處理方式不同，細胞死亡的方式不同，Glu 引起細胞死亡所激活的通路可能不同。

2 EP對小腦顆粒神經元的保護作用

EP 具有組織能量守恒、抗炎、抗氧化等藥理作用［16］，可減輕體內的全身炎癥反應和多臟器功能障礙［17］。有研究稱EP 可以治療重癥急性胰腺炎（se?vere acute pancreatitis，SAP），減輕SAP 相關的遠端器官損傷，如肝、肺和腎［18-19］。此外，EP 能減輕外傷性腦損傷和出血性腦損傷［20］。

在本研究中，EP在濃度0.1～5 mmol/L時劑量依賴性地抑制Glu 的興奮性毒性作用，充分說明EP 具有神經保護作用，可能為一種在中樞神經系統疾病中有應用前景的藥物。

3 細胞內ROS檢測結果

4 EP抑制細胞內鈣升高

Figure 1.Protective effect of ethyl pyruvate（EP）on rat cerebellar granule neurons.A-1：normal cerebellar granule neurons，scale bar=40 μm；A-2：cerebellar granule neurons treated with 100 μmol/L glutamate（Glu）for 24 h，scale bar=40 μm；A-3：cerebellar granule neurons treated with Glu（100 μmol/L）+EP（2.5 mmol/L）for 24 h，scale bar=40 μm；A-4：normal cer?ebellar granule neurons，FDA staining，scale bar=10 μm；A-5：cerebellar granule neurons treated with Glu（100 μmol/L）for 24 h，FDA staining，scale bar=10 μm；A-6：cerebellar granule neurons treated with Glu（100 μmol/L）+EP（2.5 mmol/L）for 24 h，FDA staining，scale bar=10 μm；A-7：normal cerebellar granule neurons，PI staining，scale bar=20 μm；A-8：cerebellar granule neurons treated with Glu（100 μmol/L）for 24 h，PI staining，scale bar=20 μm；A-9：cerebellar granule neurons treated with Glu（100 μmol/L）+EP（2.5 mmol/L）for 24 h，PI staining，scale bar=20 μm.B：the effect of EP（0.1～5 mmol/L）on the viability of Glu（100 μmol/L）-induced cerebellar granule neurons.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs Glu group.圖1 丙酮酸乙酯對大鼠小腦顆粒神經元的保護作用

正常情況下，細胞內的鈣濃度為100 nmol/L，比細胞外的鈣低10 000倍。細胞間隙高濃度的Glu，可引起N-甲基-D 天冬氨酸受體過度興奮，Ca2+大量內流，［Ca2+］i短暫升高；經過一段時間之后，出現第2次鈣離子升高，稱之為延遲性鈣失調，為不可逆損傷，導致細胞死亡。［Ca2+］i過高可聚集在線粒體內，損傷氧化磷酸化通道，造成ATP 不足；另一方面，Ca2+與鈣調素形成復合物，激活多種蛋白酶，引起廣泛的信號傳導分子磷酸化，而產生各種細胞效應；同時促進氧自由基產生，故細胞內鈣超載被認為是細胞死亡的最后通路［22］。

Figure 2.Detection of ROS in rat cerebellar granule neurons.A：control group，H2-DCF-DA staining；B：glutamate（Glu；100 μmol/L）group，H2-DCF-DA staining；C：Glu（100 μmol/L）+ethyl pyruvate（EP；2.5 mmol/L）group，H2-DCF-DA stain?ing；D：control group，DHE staining；E：Glu（100 μmol/L）group，DHE staining；F：Glu（100 μmol/L）+EP（2.5 mmol/L）group，DHE staining.Scale bar=50 μm.圖2 大鼠小腦顆粒神經元內ROS檢測結果

Figure 3.Detection of［Ca2+］i in rat cerebellar granule neurons.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs Glu group.圖3 大鼠小腦顆粒神經元［Ca2+］i檢測結果

本實驗中，Glu 組細胞內鈣在20 s 左右迅速升高，持續6 min 以上。而EP+Glu 組細胞內鈣較正常組升高，但顯著低于Glu組，提示EP通過抑制細胞內鈣離子濃度升高，阻斷了引起神經元損傷的上游通路。因此，抑制［Ca2+］i的升高在EP 的神經保護作用中起到很重要的作用。

5 EP 通過激活Nrf2/ARE 通路而發揮神經保護作用

Nrf2-ARE信號通路被認為是一種新型的抗氧化信號通路，以Nrf2為核心，激活一些保護性的酶的產生，如HO-1、超氧化物歧化酶及還原型谷胱甘肽；HO-1 及還原型谷胱甘肽可抑制細胞凋亡，抗氧化，緩解細胞內鈣離子超載［23］。在顱腦外傷、顱內出血和腦缺血梗死動物模型中均有Nrf2-ARE 信號通路激活。有研究顯示，移植Nrf2 過度表達的星形膠質細胞至紋狀體可減輕丙二酸誘導的細胞損害［24］；應用小干擾RNA 降低Nrf2 的表達，可引起NO 誘導的神經細胞瘤細胞的凋亡增多［25］。

本實驗結果顯示，在EP 處理組，Nrf2 轉運入核中，12 h 核內Nrf2 仍升高。免疫組化染色顯示核內Nrf2 明顯增多，ARE 介導的熒光素酶轉錄活性升高，提示EP 激活Nrf2/ARE 通路，使ARE 轉錄活性增高。同時，Glu 引起HO-1 升高，證明Glu 的氧化性損傷也可引起HO-1 升高，但12 h 即下降，說明Glu 激發的HO-1 升高所起到的保護作用有限，而EP 可引起正常小腦顆粒細胞內HO-1升高，與Glu一起，協同誘導HO-1升高，可發揮較強的抗氧化損傷作用。ZnPP部分阻滯EP 的保護作用，則說明HO-1 的保護作用是確切的。因此，EP 是通過激活Nrf2/ARE/HO-1 通路而起到保護作用。

綜上所述，我們的研究為EP 在體外對大鼠小腦顆粒神經元Glu 興奮性神經毒性的保護作用提供了實驗依據。EP 的作用機制包括抗氧化、減輕腦水腫、抑制細胞凋亡，而在HIE 發病過程中，Glu 興奮性毒性是腦損傷的主要環節，因此我們推斷EP 可能在HIE神經保護治療方面具有廣闊的應用前景。

Figure 4.The expression of Nrf2/ARE/HO-1 pathway-related proteins in rat cerebellar granule neurons.A：ethyl pyruvate（EP；2.5 mmol/L）decreased cytoplasmic Nrf2，but increased nuclear Nrf2；B：cytoplasmic Nrf2 was translocated into the nucleus after treatment with 2.5 mmol/L EP for 6 and 12 h（scale bar=20 μm）；C：EP elevated the relative luciferase activity in?duced by ARE；D-1：the expression of HO-1 after treatment with 100 μmol/L glutamate（Glu）for 0，3，6，12 and 24 h；D-2：the expression of HO-1 after treatment with 2.5 mmol/L EP for 0，3，6 and 12 h；D-3：the expression of HO-1 after treatment with 2.5 mmol/L EP+100 μmol/L Glu for 1，3 and 6 h；E：ZnPP partly inhibited the protective effect of EP against Glu excitotoxicity.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs Glu group；△P＜0.05 vs Glu+EP group.圖4 大鼠小腦顆粒神經元內Nrf2/ARE/HO-1通路相關蛋白表達的檢測結果