人卵巢壁層顆粒細胞和卵丘細胞體外分離及原代培養的比較*

朱潔茹，歐建平△，李 濤，朱偉杰

（1中山大學附屬第三醫院生殖醫學中心，廣東廣州 510630；2暨南大學生命科學技術學院，廣東廣州 510632）

當卵泡的竇腔形成后，顆粒細胞分化成兩種細胞亞群，分別為圍繞卵泡壁的壁層顆粒細胞（mural granulosa cells，MGCs）和附著于卵母細胞的卵丘細胞（cumuluscells，CCs）［1］。MGCs 含有多種激素受體，以自分泌和旁分泌的形式調控卵泡發育、成熟與甾體激素合成［2］，常用作研究卵巢功能的細胞體外模型。目前人MGCs 主要從取卵術廢棄的卵泡液中獲取［3］，來源易得，但從卵泡液中分離MGCs 需要多次離心等處理，且卵泡液中的MGCs混雜較多紅細胞和其它雜質，干擾因素多。因此，應充分闡明MGCs的細胞體外狀態，建立合適卵巢功能研究的細胞模型。

CCs是圍繞著卵母細胞生長的顆粒細胞層，與卵母細胞形成一個相輔相成的“合胞體”，為卵母細胞提供營養，調節減數分裂的恢復，影響精卵結合和早期胚胎發育［4］。在取卵術中，卵丘卵母細胞復合物被抽吸出來，隨后按體外受精（in vitro fertilization，IVF）或單精子卵胞漿內注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）的需要，一部分CCs 被切割而丟棄。這部分CCs 的獲取過程簡單，且沒有過多的其它雜質，紅細胞污染少，從理論上而言，CCs是研究卵巢功能的合適細胞體外模型。但對CCs 細胞模型的實驗方法學，以及與MGCs 細胞模型的比較仍需充分評價。

自噬和凋亡是細胞在應對環境變化時的兩種方式［5-6］，可以反映細胞的活性狀態。本項工作比較人MGCs 與CCs 體外分離及原代培養的效果，并檢測自噬和凋亡相關基因的表達來分析分離后的細胞特性，以期為深入認識MGCs 與CCs 的細胞體外狀態、建立卵巢功能研究的細胞模型提供參考資料。

材料和方法

1 顆粒細胞來源

選取16 例于中山大學附屬第三醫院生殖醫學中心行IVF/ICSI患者取卵日的卵泡液及其卵丘-卵母細胞復合物（223 個），所收集標本均為醫療廢物，由常規治療過程產生，標本獲取不影響患者的治療。所有患者均簽署知情同意書，本研究經中山大學附屬第三醫院倫理委員會批準。患者年齡24～43 歲，無合并全身重大臟器疾病或慢性內科疾病。

2 主要試劑

0.25 %胰酶、DMEM/F12 培養液和胎牛血清（fe?tal bovine serum，FBS）購自Gibco；淋巴細胞分離液（Ficoll-Paque PREMIUM）購自Pharmacia；臺盼藍和磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）購自北京索萊寶公司；卵泡刺激素受體（follicle-stimulat?ing hormone receptor，FSHR）流式抗體購自R&D Sys?tems；紅細胞裂解液購自BD；高純總RNA 快速提取試劑盒（離心柱型）、逆轉錄試劑盒和PCR 試劑購自TaKaRa；RIPA 裂解緩沖液購自上海碧云天生物技術研究所；脫脂奶粉購自Difco；GAPDH 抗體、微管相關蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）抗體、P62 抗體、Bax 抗體、Ⅱ抗羊抗兔IgG購自Proteintech。

3 方法

3.1 MGCs和CCs的分離

3.1.1 MGCs 的分離 收集拾卵后棄去的卵泡液，200×g離心10 min 后棄上清，PBS 重懸，并加入等體積的0.25%胰酶，室溫消化15 min 后用含10% FBS的DMEM/F12培養液終止消化，200×g離心10 min后棄上清，PBS 重懸，然后緩慢地小心地將懸液轉移到等量的Ficoll分離液液面上，400×g離心20 min，若此時液體未出現明顯分層，可適當加大離心力或延長離心時間。至分層明顯后，將中間顆粒細胞層小心吸出，用含10% FBS 的培養液洗滌1 次后重懸待計數。

3.1.2 CCs 的分離 拾卵時吸出卵丘-卵母細胞復合物后，在MOPS 緩沖液中用1 mL 注射器機械切割挑出卵子周邊的卵丘顆粒細胞團，并用IVF 液沖洗，隨后轉移至無菌離心管中，加入1～2 mL 0.25%胰酶，室溫下消化并反復吹打，3～5 min 后用含10%FBS 的DMEM/F12 培養液終止消化，PBS 洗滌1 次，離心后重懸待計數。

3.2 細胞計數與存活率檢測 稱量4 g 臺盼藍粉末，加入100 mL純水溶解，過濾后取濾液，即配成4%臺盼藍母液；使用時將臺盼藍母液與PBS 緩沖液以1∶9 的比例配成0.4%工作液。將MGCs 和CCs 細胞懸液稀釋成（1～10）×105/L 的密度，吸取100 μL 至EP管中，以1∶1 的比例與0.4%臺盼藍工作液混合，靜置3 min 后吸取10 μL 至血球計數板中，進行細胞計數和存活率檢測。

3.3 細胞原代培養、細胞爬片與HE染色 將MGCs和CCs 細胞懸液接種至6 孔板中，置于37℃、5%CO2的培養箱中培養，（24～48）h 換液1 次，第1 次為半量換液，以后為全量換液。培養后48 h 于顯微鏡下觀察細胞貼壁和生長狀態并拍照。繼續培養至對數生長期，留作后續qPCR和Western blot實驗。

另將部分MGCs 和CCs 分別接種至預先放有防脫載玻片的24孔板中，置于37℃、5%CO2的培養箱中培養，（24～48）h 換液1 次，第1 次為半量換液，以后為全量換液。當細胞爬滿載玻片的70%時取出載玻片進行HE染色。

3.4 細胞純度鑒定 采用流式細胞術檢測FSHR的表達以進行細胞純度鑒定。兩種細胞每106個細胞孵育10 μL FSHR 流式抗體，渦旋震蕩，室溫避光孵育30 min，隨后300×g離心5 min，棄上清后加入2 mL PBS 重懸，洗滌1 次。再加入2 mL 紅細胞裂解液，室溫避光孵育10 min，洗滌2 次。然后加入200～400 μL PBS，重懸于FACS 流式管中，置于流式細胞儀上檢測。實驗重復3次。

3.5 LC3、P62 和Bax mRNA 的qPCR 檢測 收集對數生長期的MGCs和CCs，根據高純總RNA快速提取試劑盒（離心柱型）使用說明抽提總RNA，根據逆轉錄試劑盒步驟進行逆轉錄反應，依次在PCR 反應管中加入20 反應體系，包括ddH20 7.4 μL，SYBR 10 μL，逆轉錄產物1 μL，引物1.6 μL，于PCR 儀上反應，反應條件為：94℃10 s，60℃15 s，72℃12 s，總共40個循環。所有樣本均按3個復孔加樣。引物序列見表1。

3.6 LC3、P62 和Bax 蛋白的Western blot 檢測 每個樣品根據細胞數量分別加入20～50 μL 含苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）的RI?PA 裂解緩沖液，用BCA 法檢測蛋白濃度。每孔上樣量20 μg，在15%（LC3）或12%（P62、Bax）SDSPAGE 中分離，隨后轉移到聚偏二氟乙烯（polyvinyli?dene fluoride，PVDF）膜上（LC3 采用0.22 μm PVDF膜，P62、Bax采用0.45 μm PVDF膜）。將PVDF膜在5%脫脂奶粉溶液中室溫浸泡1 h，置于含有內參抗體、目的抗體的盒子中4℃孵育過夜（抗體稀釋比例如 下：LC3 為1∶500，P62 為1∶1 000，Bax 為1∶1 000，GAPDH 為1∶1 000）。用1×TBST 洗滌后，將膜與Ⅱ抗（稀釋1∶50 000）室溫下放置1 h，1×TBST洗膜3次，超敏發光液曝光顯色及拍照。

表1 qPCR引物序列Table 1.Sequences of the primers for qPCR

4 統計學處理

細胞分離與培養實驗重復3 次。qPCR 數據用LightCycler 480 軟件進行分析，采用相對定量法比較2?ΔΔCt的值；Western blot應用ImageJ 1.48圖像處理軟件進行灰度分析。使用SPSS 20.0進行統計學分析，結果用均數±標準差（mean±SD）表示，采用兩獨立樣本t檢驗進行均數間比較。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 MGCs和CCs的分離耗時、細胞總數及存活率

CCs 的分離耗時少于MGCs，分離結束時的存活率高于MGCs，但細胞總數少于MGCs（P＜0.05）。見表2。

表2 MGCs和CCs的分離情況比較Table 2.The comparison of isolation parameters between MGCs and CCs（Mean±SD.n=16）

2 MGCs和CCs的細胞純度

使用流式細胞術檢測FSHR 的表達進行細胞純度鑒定，分離后CCs 與MGCs 的FSHR 表達量分別為（92.23±2.66）%和（81.33±6.57）%，差異具有顯著性（P＜0.05）。流式細胞術分析圖見圖1。

3 MGCs和CCs體外原代培養的生長狀態

HE 染色可見MGCs 和CCs 生長狀態良好，細胞形態呈類成纖維細胞狀，細胞偽足延展，相互連接；細胞核藍染，圓形，核仁明顯；胞質透亮呈淡紅色，可見豐富的黑色顆粒分布，見圖2。培養48 h 后，光鏡下可見細胞單層貼壁生長，呈梭形或星形，偽足呈絲狀突起，CCs 比MGCs 的細胞外觀更純凈，細胞體積更大，伸展狀態更佳，見圖2。

Figure 1.FSHR expression of MGCs and CCs after isolation.圖1 分離后MGCs和CCs的FSHR表達量

4 LC3、P62、Bax在MGCs與CCs中的mRNA表達水平

CCs 的LC3 mRNA 表達水平顯著低于MGCs（P＜0.01），Bax 的mRNA 表達水平顯著高于MGCs（P＜0.05），CCs 與MGCs 的P62 mRNA 表達水平比較，沒有顯著差異（P＞0.05）。見圖3。

5 LC3、P62 和Bax 蛋白在MGCs 與CCs 中的表達水平

CCs 的LC3-Ⅱ/Ⅰ水平顯著低于MGCs（P＜0.01），Bax 蛋白表達水平顯著高于MGCs（P＜0.05），CCs 與MGCs 的P62 蛋白表達水平比較，沒有顯著差異（P＞0.05）。見圖4。

Figure 2.The growth status of MGCs and CCs primary cultured in vitro.HE diagrams of cells climbing 70% of glass slide and light micrograph of cells after primary culture for 48 h were showed（scale bar=200 μm）.圖2 MGCs和CCs體外原代培養的生長狀態

Figure 3.The relative mRNA expression of LC3，P62 and Bax in MGCs and CCs.Mean±SD.n=16. *P＜0.05，**P＜0.01 vs MGCs.圖3 MGCs和CCs的LC3，P62，Bax mRNA表達水平

Figure 4.The protein expressions of LC3，P62 and Bax in MGCs and CCs.Mean±SD. n=3. *P＜0.05，**P＜0.01 vs MGCs group.圖4 MGCs和CCs的LC3、P62和Bax蛋白表達水平

討 論

顆粒細胞是卵泡中最大的功能細胞群，它以自分泌和旁分泌參與卵母細胞發育、成熟［7］，與卵母細胞生殖生理有著密切聯系。MGCs 和CCs 是顆粒細胞的兩個亞群，借助于MGCs和CCs的研究可以增進卵巢功能內分泌調控的認識。故此，有必要對MGCs和CCs的細胞模型進行充分評價。

以往實驗評價了多種人卵巢MGCs 的分離和提純方法，包括密度梯度離心法、裂解法和沉淀法等，但都不可避免出現分離耗時長、細胞純度低等問題［8］，直接影響了細胞體外狀態及模型的效果。在本實驗，我們采用機械切割法+酶解法分離CCs，分離耗時顯著少于密度梯度離心法分離MGCs。成熟卵子周圍的卵丘細胞團主要成分是CCs 和透明質酸等細胞外基質，故此，分離CCs 只需要把卵丘細胞團從卵丘-卵母復合物中切割出來，用胰酶或透明質酸酶把透明質酸消化即可，操作簡單，因而耗時少。而密度梯度離心法利用淋巴細胞分離液離心后形成不同的密度梯度，卵泡液中的各種細胞成分根據密度不同分布在離心管內不同層面，從而實現細胞的分離純化［9-10］。由于分離MGCs 需收集卵泡液，卵泡液量多，要作多個離心管分裝進行分離，且加在分離液層上的卵泡液一般約3 mL，否則會影響細胞的沉降速度［11］；加上該分離方法需要多次離心，整個操作過程較為繁瑣，故分離MGCs耗時較長。

FSHR 特異性表達于顆粒細胞，可用于鑒定顆粒細胞的純度［12］。在本研究中，應用流式細胞術比較分離后CCs 與MGCs 的FSHR 的表達，結果顯示CCs細胞純度高于MGCs。由于卵泡液成分復雜，含有大量紅細胞、少量白細胞和其他成分［13］，難以通過離心完全棄去雜質，導致分離后MGCs仍混有其他細胞成分，使細胞純度降低。此外，密度梯度離心法分離MGCs 需要時間長于CCs 分離法，且MGCs 須經歷多次離心洗滌程序，離心力會對細胞造成損傷［14］，上述因素可能導致MGCs存活率顯著低于機械切割法+酶解法分離CCs，這是應用MGCs 模型須注意的問題；另一方面，相對于從卵泡液可收集到MGCs，CCs 是顯微鏡下對卵丘-卵母細胞復合物作切割獲得，切割出來的CCs 包裹著大量的黏液團，其為細胞外基質成分。為避免黏液團的黏性限制CCs 在體外生長［11］，本實驗采用胰酶消化。由圖2 可見，消化了黏液團后的CCs比MGCs生長的體積更為飽滿，偽足伸展性更佳，貼壁更好。MGCs在分離時難分散成單個細胞，培養時細胞容易成團塊狀生長，限制了其延展，且分離的MGCs 不可避免混有紅細胞，紅細胞沉降在培養皿底部，影響了細胞的貼壁。因此，在體外培養，CCs比MGCs顯示出更好的細胞延展性。

CCs 和MGCs 需經歷分離、純化等一系列人為操作才作為細胞模型用于實驗。為了解體外處理后的細胞狀態，除了細胞存活率，本研究采用了自噬和凋亡基因的表達變化來進一步了解細胞特性。LC3 是自噬延伸階段的重要泛素化蛋白，其數量和自噬體的數量呈正相關，是分析自噬強弱的指標［15］；選擇性接頭蛋白P62可用于評估自噬流的通暢程度［16］；Bax是B 細胞淋巴瘤/白血病2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）家族中的促凋亡蛋白，通常認為它的激活是導致凋亡發生的重要事件［17］。結果表明，CCs 與MGCs 的P62 mRNA 和蛋白表達水平沒有顯著差異，提示兩種細胞的自噬流通暢程度相似；CCs 中LC3 mRNA 和LC3-II/I 的水平顯著低于MGCs，而Bax mRNA 和蛋白的表達水平顯著高于MGCs，提示在體外培養下，CCs 可能比MGCs 有較低的自噬活性和較高的凋亡活性，這種情況或許與CCs 脫離了卵母細胞有關。在體內，CCs圍繞卵母細胞生長，卵丘-卵母復合物形成獨特的微環境，CCs的生理功能受卵母細胞分泌因子的調控，卵母細胞分泌因子可保護CCs免于凋亡［18］，而CCs 脫離了卵母細胞，失去了卵母細胞分泌因子的調控，有可能使細胞的凋亡活性升高。

綜上所述，CCs 比MGCs 分離提純更高效。機械切割法+酶解法分離CCs 方法簡便，收集細胞的純度高，細胞狀態良好，可用于原代培養實驗。如需長期體外培養，單獨的CCs 可能容易發生凋亡，或需加入卵母細胞分泌因子等模擬CCs 在體內的微環境，以提高CCs體外培養的穩定性。