HPLC法檢測膏藥中硫酸阿托品含量方法的建立

吳春燕 張立軍 張新玥 張轉(zhuǎn)平

【摘 要】 目的：建立高效液相色譜法檢測膏藥中硫酸阿托品的含量測定方法，用于市售止痛膏藥的藥品質(zhì)量控制。方法：采用萃取技術(shù)處理不同膏藥樣品，得含量測定分析提取物。采用HPLC技術(shù)，以O(shè)DS C18色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm），乙腈-磷酸鹽緩沖液（取6.8 g磷酸二氫鉀溶于1000 mL水中，加入10 mL三乙胺，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.8）（7∶93）為流動相，流速為1 mL·min-1，檢測波長為210 nm，進(jìn)樣體積10 μL，測定不同廠家止痛膏藥中硫酸阿托品含量。結(jié)果：建立了止痛膏藥中硫酸阿托品含量測定方法，其在0.088 2～0.882 0 μg具有良好的線性，平均回收率為95.73%，不同廠家止痛膏藥中硫酸阿托品含量范圍為0.06～0.39 mg/100cm2，含量差異很大。結(jié)論：該法簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高，重現(xiàn)性好，可以用于止痛膏藥中硫酸阿托品含量測定及質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】 止痛膏藥;質(zhì)量控制;硫酸阿托品;高效液相色譜法;含量測定

【中圖分類號】R284?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2021）22-0029-05

Establishment for Methods of Atropine Sulfate in Acesodyne Plaster by HPLC

WU Chunyan1 ZHANG Lijun1 ZHANG Xinyue2 ZHANG Zhuanping1*

1. Ankang Inspection and Detection Center of Food and Drug Control， Ankang 725000，China;

2.Beijing University of Traditional Chinese Medicine， Beijing 100029，China

Abstract：Objective? To establish a method for the determination of atropine sulfate in acesodyne plaster by high performance liquid chromatography （HPLC）. Used for quality control of acesodyne plaster.Method ?Extraction technology was used to extract the atropine sulfate in acesodyne plaster from different production enterprises， HPLC method was developed to determination of atropine sulfate in acesodyne plaster from different production enterprises， and the contents were determined by Phenomenex ODS C18 （4.6 mm×250 mm， 5 μm）， with acetonitrile-phosphate buffered salt solution as the mobile phase for isocratic elution （7∶93）， the flow rate was 1 mL.min-1， the detection wavelength was 210 nm， injection volume was 10 μL. Result? The common mode for the determination of atropine sulfate in acesodyne plaster was established. A linear range of 0.088 2～0.882 0 μg， the mean recovery 95.73%. The content of atropine sulfate in analgesic plasters from different production enterprises varies greatly， the range of 0.06～0.39 mg/100cm2. Conclusion The method showed to be simple， quick， sensitive， accurate， reproducible and can be used to content determination and control quality of acesodyne plaster from different production enterprises.

Keywords：Acesodyne Plaster; Quality Control; Atropine Sulfate; HPLC; Content Determination

止痛膏為《中華人民共和國藥典》2010、2015、2020年版收載的制劑，主要以止痛流浸膏、水楊酸甲酯、薄荷腦、冰片、蕓香浸膏、顛茄浸膏等七味藥為原料，另加基質(zhì)制成膏藥。具有祛風(fēng)濕、活血止痛等功效。用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肌肉疼痛、關(guān)節(jié)腫痛等病癥[1-3]，是國家基本用藥目錄收載品種[3- 4]。顛茄浸膏為止痛膏的重要組成部分，具有抗膽堿、解除平滑肌痙攣、抑制腺體分泌的作用，可用于胃及十二指腸潰瘍，胃腸道、腎、膽絞痛等，外用可解除肌肉痙攣，從而達(dá)到止痛的效果，是止痛外用膏藥的主要成分。而硫酸阿托品是顛茄浸膏指標(biāo)性成分和功效成分[5-7]。《中華人民共和國藥典》（2015年版及2020年版）收載止痛膏藥品中只見硫酸阿托品薄層鑒別，不能很好控制企業(yè)生產(chǎn)的膏藥質(zhì)量[3， 8-10]。顛茄浸膏藥性俊烈，具有一定的毒性，與諸多藥品具有使用配伍禁忌，有必要對其進(jìn)行質(zhì)量控制[11]。市場膏藥質(zhì)量參差不齊，不同生產(chǎn)廠家的止痛膏藥樣品中硫酸阿托品含量差異較大，存在非法或超劑量添加等情況，有必要提升控制標(biāo)準(zhǔn)，建立其含量測定控制線，保證膏藥質(zhì)量與患者用藥安全。《中華人民共和國藥典》（2015年版和2020年版）中僅對膏藥進(jìn)行了薄層色譜鑒別，難以控制其質(zhì)量。本次研究，對止痛膏中硫酸阿托品進(jìn)行了提取分離、含量測定，以期對市售止痛膏藥品進(jìn)行質(zhì)量控制。該方法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，可為市售膏藥質(zhì)量控制提供思路。

1 儀器與試藥

島津LC-20AT型高效液相色譜儀，LC Solution色譜工作站;Phenomenex ODS C18色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）;硫酸阿托品購自中國藥品生物制品檢定所（供含量測定用，批號100040-201312），乙腈為色譜純，水為超純水，三氯甲烷、磷酸二氫鉀、三乙胺、磷酸、氨水均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Phenomenex ODS C18色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm），流動相為乙腈-磷酸鹽緩沖液（取6.8 g磷酸二氫鉀溶于1000 mL水中，加入10 mL三乙胺，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.8）（7∶93）為流動相等度洗脫，流速為1 mL·min-1，檢測波長為210 nm，柱溫40 ℃，進(jìn)樣體積10 μL。在上述色譜條件下樣品中硫酸阿托品與其它組分分離較好，結(jié)果如圖1所示。

2.2 對照品溶液的制備 取硫酸阿托品對照品約20 mg，精密稱定，置20 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，濃度為0.882 0 mg/mL備用，存貯于4 ℃冰箱中備用。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 提取溶劑的選擇 止痛膏中膏藥一般用三氯甲烷或乙醚提取[3，12-13]。取樣品（陜西東科，批號：150708）適量，2份（片），分別加入三氯甲烷、乙醚洗盡布襯膏藥，再用0.5%硫酸溶液提取4次，合并酸液，再用氨水調(diào)至PH為10～11，再分別用三氯甲烷、乙醚萃取4次，水浴蒸干，用流動相定容，過濾，按“2.1”色譜條件進(jìn)行分析，測定峰面積，結(jié)果顯示，相比于三氯甲烷處理，乙醚萃取轉(zhuǎn)移率較低，故選用三氯甲烷處理，見表1。

2.3.2 酸提與堿沉次數(shù)的選擇[14-17] 取樣品（陜西東科，批號：150708）適量，分成8份（片），加入三氯甲烷洗盡布襯膏藥，分別置分液漏斗中。用0.5%硫酸溶液振搖提取，每次40 mL，考察提取次數(shù)（2、3、4次），合并提取液，置分液漏斗中（酸提）。再用氨水調(diào)至PH為10～11，分別用三氯甲烷振搖萃取，每次40 mL，考察萃取次數(shù)（2、3、4次），合并萃取液，分別置于蒸發(fā)皿中水浴蒸干（堿萃）。殘?jiān)恿鲃酉嗳芤憾ㄈ?0 mL容量瓶中，按“2.1”色譜條件進(jìn)樣分析，分別測定峰面積。結(jié)果顯示，0.5%硫酸溶液提取3次調(diào)堿后三氯甲烷萃取4次，樣品中硫酸阿托品轉(zhuǎn)移率為98.00%（631871/644767）;0.5%硫酸溶液提取3次調(diào)堿后三氯甲烷萃取3次，樣品中硫酸阿托品轉(zhuǎn)移率為97.84%（618212/631871），見表2。故選擇用0.5%硫酸溶液提取3次，調(diào)堿后三氯甲烷萃取3次即可。

2.3.3 供試品溶液的制備 綜上分析，收集不同廠家生產(chǎn)的膏藥，做好標(biāo)記，剪去適量面積（cm2），平行2份。加入三氯甲烷洗盡布襯膏藥，置分液漏斗中，分別用0.5%硫酸溶液提取3次，每次40 mL，合并酸溶液，用氨水調(diào)至PH為10～11，置分液漏斗中，再用三氯甲烷萃取3次，每次40 mL，合并三氯甲烷萃取液，水浴蒸干，用流動相定容至10 mL量瓶中，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取硫酸阿托品對照品儲備溶液（0.882 0 mg/mL）0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0 mL，用甲醇溶解定容至5 mL，搖勻。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測定峰面積，以峰面積Y對進(jìn)樣量X作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸線方程為Y=1×107X+5357.9，r=0.9991，結(jié)果表明硫酸阿托品在0.088 2 ～0.882 0 μg范圍內(nèi)具有良好的線性。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液（陜西東科，批號150708），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測定硫酸阿托品的峰面積，計(jì)算其RSD為1.07%（n=6），表明儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液（陜西東科，批號150708），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、3、6、9、12、24 h進(jìn)樣分析，測定峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，樣品中硫酸阿托品含量的RSD為1.75%（n=6）。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品6份（陜西東科，批號150708），按“2.3.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法和“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測定峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果表明，本法有良好的重復(fù)性，樣品中硫酸阿托品含量的RSD為1.45%（n=6）。

2.8 回收率試驗(yàn) 取已知含量的同一批（陜西東科，批號：150708，含量為0.38 mg/100 cm2）樣品適量，平行6份，分別加入硫酸阿托品對照品約0.50 mg（對照品儲備液500 μL），按“2.3.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法和“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測定峰面積，計(jì)算回收率（%），平均回收率為95.73%，RSD為0.39%，結(jié)果見表3。

2.9 不同廠家膏藥中硫酸阿托品含量測定 取不同廠家止痛膏供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算不同廠家止痛膏藥中硫酸阿托品的含量。結(jié)果顯示，不同廠家生產(chǎn)止痛膏樣品中硫酸阿托品含量差異較大，含量范圍在0.06～0.39/100 cm2，結(jié)果見表4。

3 討論

3.1 樣品處理考察 本次研究分別考察了不同提取溶劑、萃取次數(shù)及溶劑用量對止痛膏中硫酸阿托品提取結(jié)果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用三氯甲烷萃取轉(zhuǎn)移率優(yōu)于乙醚，可能是因?yàn)橐颐演腿r(shí)容易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，造成成分萃取不完全;乙醚容易揮發(fā)、易爆及危險(xiǎn)系數(shù)高，最終決定采用三氯甲烷作為提取和萃取溶劑[13， 17]。同時(shí)也考察了提取與萃取溶劑用量、萃取次數(shù)及PH對樣品中硫酸阿托品轉(zhuǎn)移的影響，最終優(yōu)選出上述樣品處理方法。

3.2 色譜條件考察 實(shí)驗(yàn)分別考察了甲醇-水溶液、乙腈-水溶液、甲醇-磷酸緩沖鹽溶液、乙腈-磷酸緩沖鹽溶液，柱溫分別考察了30、 40 ℃對分離效果的影響，最終優(yōu)選出色譜條件為乙腈-磷酸緩沖鹽溶液等度洗脫（7∶93），流速為1 mL·min-1，檢測波長為210 nm，柱溫40 ℃，分析時(shí)間50 min。

3.3 耐用性與重現(xiàn)性考察 在上述優(yōu)選的條件下，分別考察了不同品牌的C18色譜柱（Phenomenex ODS C18、DiKMA spursil C18及Agilent ZORBAX SB-C18）、高效液相色譜儀（安捷倫與島津）及更換不同的分析人員在不同的實(shí)驗(yàn)室（化學(xué)室與中藥室）對含量測定結(jié)果的影響，結(jié)果顯示新建立的止痛膏中硫酸阿托品含量測定方法耐用性及重現(xiàn)性均很好，RSD均小于3%。

3.3 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 通過加入對照品回收實(shí)驗(yàn)分析，平均回收率為95.7%，RSD為0.39%，結(jié)果顯示優(yōu)選的方法具有很好的回收效果。

3.4 膏藥中硫酸阿托品含量測定方法小結(jié) 本研究采用溶劑萃取技術(shù)處理不同膏藥樣品，得含量測定分析提取物，通過對提取溶劑選擇、酸提堿沉次數(shù)及溶劑用量等進(jìn)行考察，結(jié)果顯示，該方法被測成分硫酸阿托品轉(zhuǎn)移率高，轉(zhuǎn)移率為97.84%（618212/631871）建立了膏藥樣品處理方法。采用HPLC法建立膏藥中硫酸阿托品含量測定方法，通過專屬性、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)以及耐用性與重現(xiàn)性考察，該法簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高，重現(xiàn)性好，可以用于止痛膏藥中硫酸阿托品含量測定及質(zhì)量控制。本次實(shí)驗(yàn)測定數(shù)據(jù)顯示，不同生產(chǎn)廠家的止痛膏藥樣品中硫酸阿托品含量差異較大，顛茄浸膏/流浸膏作為止痛膏重要組成部分，其硫酸阿托品為顛茄浸膏/流浸膏主要指標(biāo)和功效成分，建立膏藥中硫酸阿托品含量測定方法可以很好的用于膏藥質(zhì)量控制。

參考文獻(xiàn)

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：767-768.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：847-848.

[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2020：893-894.

[4]王莉，袁強(qiáng)，成嵐，等.我國基本藥物目錄遴選與評價(jià)方法的問題與反思[J].中國藥房，2010，10（16）：1453-1456.

[5]孫凱，楊麗敏.山莨菪堿的藥理和臨床研究進(jìn)展[J].世界臨床藥物，2010，31（3）：182-186.

[6]周華成，董燕斐，代小奇，等.東莨菪堿對骨癌痛鼠嗎啡鎮(zhèn)痛效果的影響[J].中國疼痛醫(yī)學(xué)雜志，2011，17（11）：682-685.

[7]王宇卿，莊果，王曉瑜，等.基于UPLC-ESI-Q-TOF-MS～E技術(shù)分析顛茄草化學(xué)成分[J].藥物分析雜志，2019，39（6）：1063-1068.

[8]張文婷，馬臨科，黃琴偉，等.中國藥典2015年版顛茄草類制劑修訂情況及操作要點(diǎn)[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2016，33（5）：623-625.

[9]張小山.對維U顛茄鋁制劑中不同顛茄料源性質(zhì)的分析判定與監(jiān)管[J].中國藥物與臨床，2013，13（3）：132-134.

[10]蘇曉紅，林華明.測定顛茄流浸膏含量的幾點(diǎn)體會[J].基層中藥雜志，1999，10（1）：3-5.

[11]嚴(yán)瑋.含顛茄生物堿中藥及其制劑與西藥的配伍禁忌[J].實(shí)用中醫(yī)藥雜志，2011，27（12）：874.

[12]吳玉婷，呂偉旗，湯晟凌.6省13個(gè)產(chǎn)地顛茄草中2種成分測定及相關(guān)性分析[J].中成藥，2019，41（7）：1618-1623.

[13]彭拓華，鐘世順，張少俊，等.三種提取方法提取洋金花生物堿的比較研究[J].中成藥，2012，34（5）：832-835.

[14]黃偉，張文婷，趙維良，等.顛茄流浸膏真?zhèn)舞b別及含量測定方法研究[J].藥物分析雜志，2012，32（1）：151-154.

[15]莊果，王宇卿，熊偉，等.RP-HPLC法同時(shí)測定顛茄草5個(gè)部位中2種成分[J].中成藥，2017，39（12）：2560-2563.

[16]張文婷，張春陽，黃偉，等.湖南產(chǎn)顛茄草不同生長期8個(gè)成分的動態(tài)變化及不同部位分布特征[J].中草藥，2016，47（22）：4072-4075.

[17]張立軍，戴海蓉，楊志軍，等.高烏頭炮制前后鎮(zhèn)痛抗炎活性部位HPLC指紋圖譜建立及質(zhì)量研究[J].中草藥，2017，48（12）：2442-2447.

（收稿日期：2021-03-20 編輯：劉 斌）

基金項(xiàng)目：陜西省社會發(fā)展科技攻關(guān)項(xiàng)目（2015SF286）。

作者簡介：吳春燕（1976-），女，漢族，本科，副主任藥師，研究方向?yàn)樗幬锓治雠c質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail：554633883@qq.com

通信作者：張轉(zhuǎn)平（1966-），男，漢族，本科，主任藥師，研究方向?yàn)樗幬锓治雠c質(zhì)量準(zhǔn)研究。E-mail：715401074@qq.com