二十五味珊瑚丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

王智森，賀巧娟，劉文全，許 甜，劉東樂(lè)

（1.河北省藏藥質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，河北石家莊 050035；2.西藏藏諾藥業(yè)股份有限公司，西藏日喀則 857000）

二十五味珊瑚丸[1]以珊瑚、紅花為君藥，珊瑚安神鎮(zhèn)驚，紅花活血祛瘀，通經(jīng)止痛；以珍珠、珍珠母、朱砂、龍骨、磁石、腦石等藥為臣藥，使本方鎮(zhèn)靜安神之功效顯著，且龍骨、磁石還具平肝潛陽(yáng)的作用；并佐以廣木香、沉香、榜那、訶子、打箭菊等藥，行氣止痛；以菖蒲、麝香為使藥，使本方具有醒神開竅、通絡(luò)止痛功效，且可引諸藥上行頭部取得更好的治療效果；最后輔以甘草調(diào)和諸藥，且能制約榜那的毒性。本方在鎮(zhèn)靜安神、活血祛瘀、行氣止痛的同時(shí)，還加用芝麻、獐牙菜等藥健胃、利濕、補(bǔ)益五臟。其作用主要為：安神鎮(zhèn)靜，活血祛瘀，行氣止痛，使血脈暢通，調(diào)節(jié)人體陰陽(yáng)，并能祛風(fēng)除濕，驅(qū)散外邪。所以對(duì)各種頑固性頭痛均有良好的治療作用。

1 儀器與試藥

1.1 儀器液相

LC-20A，日本島津；超聲儀（40k Hz）：QTR20500 震浪；超純水制備儀：Medium-RS45上海和泰；薄層板：煙臺(tái)華陽(yáng)。

1.2 試藥

西紅花苷I（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111588-201704）和西紅花苷Ⅱ?qū)φ掌罚ㄖ袊?guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111589-201705）；二十五味珊瑚丸（藏諾生產(chǎn)市售，批號(hào)：180802、180803、180801）；甲醇為色譜純；水為重蒸餾水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

保留《2015版中國(guó)藥典》[2]二十五味珊瑚丸項(xiàng)下理化與薄層鑒別及含量限定，毒性成分限定，增加以下內(nèi)容。

2.1 鑒別

（1）取本品，置顯微鏡下觀察：油細(xì)胞圓形，直徑約50μm，含黃色或黃棕色油狀物（藏菖蒲）；以花粉粒或柱頭為主：花粉粒無(wú)色，具3副合溝；以各種團(tuán)塊為主塊為半透明狀，形狀不一，其上可見細(xì)密波狀紋理；菊糖團(tuán)塊呈扇形，現(xiàn)放射狀線紋理；以纖維為主：韌皮纖維淡黃色，常單個(gè)離散，壁厚，木化，有單斜紋孔，切向壁紋孔少見；不規(guī)則細(xì)小顆粒暗棕紅色，有光澤，邊緣暗黑色

（2）取本品1g，研細(xì)，加丙酮20mL，超聲處理20min，濾過(guò)，取藥渣0.2g，置安瓿中，加稀鹽酸試液5mL，封口，置烘箱中，在105℃加熱20h，取出，上清液作為供試品溶液。另取珍珠對(duì)照藥材0.02g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各4μl，分別點(diǎn)于同硅膠G薄層板上，以苯酚-水（7∶2）為展開劑，展開，取出，在105℃加熱5~10min，立即噴以0.2%茚三酮乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的紫紅色斑點(diǎn)。

（3）取本品粉末3g，加乙醚10mL，振搖數(shù)分鐘，濾過(guò)，濾液揮散至1mL，作為供試品溶液。另取丁香酚對(duì)照品，加乙醚制成每1mL中含5μL作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（附錄57頁(yè)）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以醋酸乙酯-石油醚（60~90℃）（1∶9）為展開劑，展開、取出、晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，電熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的黃棕色斑點(diǎn)。

（4）取本品1g，研細(xì)，加石油醚（60~90℃）20mL，超聲處理30min，濾過(guò)，濾液濃縮至1mL，作為供試品溶液。另取木香對(duì)照藥材0.05g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（30~60℃）-乙酸乙酯（9∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

（5）取本品2g，研細(xì)，加乙醇20mL，超聲處理2min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)右掖?mL使溶解，作為供試品溶液。訶子0.4g對(duì)照藥材，同法制成對(duì)照藥材溶液，另取沒(méi)食子酸對(duì)照品，加乙醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取供試品溶液10μl、對(duì)照品溶液5μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（6∶4∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鐵乙醇溶液。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的黑色斑點(diǎn)。

（6）取本品10g，研細(xì)，加乙醇30mL，加熱回流30min，濾過(guò)，濾液揮干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。另取藏菖蒲對(duì)照藥材0.5g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60~90℃）-乙酸乙酯（4∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的主斑點(diǎn)。

2.2 含量測(cè)定

色譜條件：色譜柱：C18柱（250min*4.6mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇/水（52∶48），流速為0.8mL/min 檢測(cè)波長(zhǎng)為440nm，柱溫為25℃，進(jìn)樣量10μL。理論板數(shù)按西紅花苷I峰計(jì)算應(yīng)不低于3 500。

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取西紅花苷I對(duì)照品和西紅花苷Ⅱ 對(duì)照品適量，分別加乙醇制成每mL含330μg的溶液，即得，作為貯備液。

2.2.2 供試品溶液的制備

取二十五味珊瑚丸0.3g，精密稱定，置50mL棕色量瓶中，加入乙醇適量，置水浴中超聲處理20min放置室溫，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，通過(guò)孔徑為0.45μm的微孔濾膜，取續(xù)濾液，作為供試品。

2.2.3 空白對(duì)照溶液的制備

將依照處方比例但不含西紅花的空白制劑，按供試品溶液的制備方法制成空白對(duì)照樣品溶液。

2.2.4 線性關(guān)系考察

①精密吸取西紅花苷I與Ⅱ?qū)φ掌焚A各液0.5mL、1mL、2mL、2.5mL、4mL、5mL，分別置于5mL容量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，分別進(jìn)樣10ul，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積積分值對(duì)進(jìn)樣濃度進(jìn)行回歸處理。結(jié)果表明，西紅花苷I在33~330μg呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。回歸方程為A=1 634M-0.908 9，r=0.999 9。

②精密吸取西紅花苷Ⅱ 對(duì)照品貯備液1mL、2mL、3.2mL、4mL、5mL，分別置于5mL容量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，分別進(jìn)樣10μL，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積積分值對(duì)進(jìn)樣濃度進(jìn)行回歸處理，結(jié)果表明，西紅花苷Ⅱ 在62~310μg，有良好的線性關(guān)系，回歸方程為A=0.1688M-0.9143，r=0.9998。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

照2.2項(xiàng)下，對(duì)同一批樣品含量測(cè)定6次，結(jié)果顯示二十五味珊瑚丸中西紅花苷I和西紅花苷Ⅱ的總量的平均含量為0.1307%，西紅花苷I和 西 紅花苷Ⅱ的 RSD分別為1.06% 和 0.95%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取2.2項(xiàng)下供試品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定西紅花苷的色譜峰面積。得出總量峰面積西紅花苷I RSD為0.64%和西紅花苷Ⅱ的0.51%，表明該方法的精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取2.2項(xiàng)下供試品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，按0、1.5、3、6、8、24h間隔進(jìn)樣，測(cè)得西紅花苷I和西紅花苷Ⅱ 的總量，以考察其穩(wěn)定性。分析得出西紅花苷I RSD為1.44%，西紅花苷Ⅱ?yàn)?.28%。表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 陰性對(duì)照試驗(yàn)

精密吸取空白樣品溶液、供試品溶液和對(duì)照品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，可以看出在空白樣品色譜圖中，與西紅花苷對(duì)照品峰對(duì)應(yīng)處無(wú)吸收峰。

2.2.9 加樣回收試驗(yàn)

取同一批樣品6份，每份約0.3g精密稱定，置棕色容量瓶中，分別加入0.33mg/mL的西紅花苷I和0.13mg/mL西紅花苷Ⅱ?qū)φ掌啡芤焊?mL，按上述供試品溶液的制各方法制備，依法測(cè)定，平均回收率100.05%，RSD 為 1.9%。

2.2.10 樣品中西紅花苷I和西紅花苷Ⅱ的平均含量測(cè)定

取3批二十五味珊瑚丸，分別按照2.3.2項(xiàng)下方法制各待測(cè)樣品。按上述色譜條件分別測(cè)定西紅花苷I和西紅花苷Ⅱ 的總量，并計(jì)算西紅花苷的平均含量1.31mg/g。

參考中國(guó)藥典2015版西紅花標(biāo)準(zhǔn)與二十五味珍珠丸藥典標(biāo)準(zhǔn)，暫定西紅花苷I和西紅花苷Ⅱ 的總量不少于1.0mg/g。

2.4 討論

（1）超聲時(shí)間的選擇。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，供試品制備采用冰浴中分別超聲（功率 600W，頻率 40kHz）20、25、30、40、50min，依法測(cè)定峰面積，結(jié)果表明，超聲提取20min時(shí)的測(cè)定值略高，故選擇提取時(shí)間為 20min。

（2）測(cè)定波長(zhǎng)的選擇。對(duì)西紅花苷I和西紅花苷Ⅱ進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果在440nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故選擇440nm作為 測(cè)定波長(zhǎng)。

3 結(jié)語(yǔ)

本文所建立的質(zhì)量控制方法可準(zhǔn)確地進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，方法可靠，重復(fù)性好，可有效控制二十五味珊瑚丸的質(zhì)量。