線粒體自噬抑制劑Mdivi-1調控線粒體未折疊蛋白反應改善癲癇海馬神經元損傷

謝南昌，杜麗媛，連亞軍，王 翠，孟祥荷，李鈺娟，劉鳳霞

近年研究指出線粒體功能障礙可能是癲癇的核心發病機制，并與癲癇神經元選擇易損性密切相關[1]。線粒體未折疊蛋白反應(mitochondrial unfolded protein response,mtUPR)作為新發現的線粒體蛋白質量控制系統，是指在各種應激條件下，線粒體為了維持其蛋白質的穩態，啟動由核DNA編碼的線粒體熱休克蛋白和蛋白酶等基因群轉錄活化程序的應激反應[2]。在哺乳動物細胞，線粒體基質內蛋白質積累可造成AP-1選擇性誘導CHOP而導致線粒體內熱休克蛋白HSP60、mtDnaJ和線粒體蛋白酶ClpP表達量升高[3]。因此，mtUPR可及時感知線粒體內蛋白穩態破壞，幫助折疊蛋白恢復正常蛋白構象及協助新合成蛋白正確折疊，防止損害繼續擴大[4]。最近，國外研究發現在癲癇動物模型及顳葉癲癇患者中海馬神經元HSP60表達水平明顯升高[5]。

線粒體自噬是一種選擇性的自噬過程，是降解損傷線粒體，維持細胞內環境穩態和線粒體功能的一種重要途徑。但過度或者紊亂的線粒體自噬會導致細胞內線粒體過度降解從而引起細胞能量代謝障礙，甚至細胞死亡。近年研究發現能夠誘導mtUPR的刺激也最終能夠誘導線粒體自噬的發生[6]。以往研究發現線粒體自噬抑制劑Mdivi-1在癲癇海馬神經元中發揮神經保護作用[7]，但其對線粒體未折疊蛋白反應的作用仍然未知。

本研究中，我們利用體外海馬神經元癲癇模型觀察海馬神經元CHOP、HSP60和ClpP的動態表達變化，從線粒體未折疊蛋白反應角度探討癲癇神經損傷的可能機制；并進一步探討線粒體自噬抑制劑Mdivi-1對線粒體未折疊蛋白反應的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物與實驗試劑 新生24 h以內健康SD大鼠，SPF級。試劑：無鎂外液(2.5 mmol/L KCl、145 mmol/L NaCl、10 mmol葡萄糖、0.002 mmol/L甘氨酸、2 mmol/L CaCl2和10 mmol/L HEPES，pH 7.4)；正常細胞外液(無鎂外液各成分+1 mmol/L MgCl2)；PBS液；RIPA裂解緩沖液；線粒體熒光探針MitoSOX(Invitrogen)；Rhodamine123(Sigma)；β-actin、CHOP、線粒體內熱休克蛋白HSP60、線粒體蛋白酶ClpP、CytC和caspase-3抗體(CST)；線粒體自噬抑制劑Mdivi-1(Abcam)。

1.2 原代海馬神經元的培養 新生24 h內的SD大鼠，用酒精消毒后，斷頭取腦，將其放置加有預冷PBS的培養皿中，在無菌條件下分離雙側海馬組織并將其表面血管剔除后，剪成約1 mm3的組織塊至15 ml離心管中，加入0.125%的胰酶在37 ℃恒溫箱消化15 min，期間輕微震蕩數次后加入PBS洗滌并終止消化，以1500 r/min轉速離心5 min后棄上清，用PBS洗滌后加入種植培養液制成細胞懸液。調整細胞密度為4×105個/孔接種于預先用0.01% L-多聚賴氨酸包被的6孔培養板中，置于37 ℃恒溫箱、5% CO2培養箱中培養4 h后等量更換為維持培養液繼續培養，之后每2 d半量更換維持培養液培養至14 d即可用于后續的實驗。

1.3 大鼠海馬神經元癲癇模型的建立與實驗分組

1.3.1 造模 用維持培養液培養至14 d后，棄去維持培養液，用無鎂外液沖洗3次后加入無鎂外液培養3 h誘導海馬神經元癲癇模型。

1.3.2 實驗分組 將原代海馬神經元隨機分為：(1)對照組(CON組)：正常細胞外液處理神經元3 h后繼續用維持培養液培養；(2)無鎂誘導組(AE組)：用無鎂外液分別處理神經元3 h、12 h、24 h后繼續用維持培養液培養；(3)AE+DMSO組(陰性對照組)：用5 μl DMSO處理神經元30 min后繼續用維持培養液培養，最后用無鎂外液分別處理神經元3 h；(4)AE+Mdivi-1組：將25 μmol Mdivi-1溶解于5 μl DMSO中處理神經元30 min后繼續用維持培養液培養，最后用無鎂外液分別處理神經元3 h。

1.4 神經元純度檢測 海馬神經元在放置有爬片的24孔板中生長至7 d可進行NSE染色鑒定神經元純度。棄去培養液，用PBS漂洗一遍后用4%多聚甲醛固定30 min后，PBS漂洗3次，每次5 min；然后用0.2% TritonX-100破膜5 min，吸棄TritonX-100后，用PBS漂洗3次，每次5 min；加入兔抗大鼠NSE多克隆抗體4 ℃過夜，TBST漂洗3次，每次5 min；加入山羊抗兔熒光二抗，避光孵育1 h，TBST漂洗3次，每次5 min；滴加10 μl含DAPI的抗熒光衰減封片劑于載玻片上，取出細胞爬片并蓋在載玻片上。在400倍熒光顯微鏡下隨機選擇10個視野觀察，計算NSE陽性細胞率并取均值即為神經元純度。

1.5 線粒體ROS生成水平檢測 利用線粒體熒光探針MitoSOX評估線粒體ROS生成水平。胰蛋白酶處理原代小膠質細胞，然后用5 μmol/L MitoSOX工作液37 ℃避光孵育15 min，PBS清洗，再通過流式細胞術來評估線粒體ROS生成水平，結果通過各單位的熒光強度來表示。

1.6 線粒體膜電位水平檢測 利用Rhodamine123檢測線粒體膜電位水平。棄去細胞上清液后用PBS緩沖液清洗，然后加入Rhodamine123染液5 μg/ml，置于37 ℃、5% CO2孵育箱中孵育10 min，PBS清洗后，用流式細胞術評估線粒體膜電位水平，結果通過Rhodamine123的熒光強度來表示。

1.7 Western blotting分析 檢測CHOP、HSP60、ClpP、CytC、caspase-3蛋白表達水平。加入RIPA裂解緩沖液裂解各組海馬神經元提取蛋白，BCA法檢測各組蛋白濃度，調整上樣體積至每個泳道蛋白量相等；12% SDS-PAGE凝膠電泳(上層膠80 V 30 min，下層膠120 V 90 min)，電泳結束后將膠上的蛋白質條帶轉移至PVDF膜上；5%脫脂奶粉封閉2 h；一抗β-actin(1∶3000)、CHOP(1∶500)、HSP60(1∶1000)、ClpP(1∶1000)、CytC(1∶1000)、caspase-3(1∶500)孵育，4 ℃過夜；10% TBST洗膜3次，每次10 min；二抗常溫孵育1 h，10% TBST洗膜3次，每次10 min；最后使用增強化學發光法觀察。

2 結 果

2.1 神經元純度檢測 體外原代培養海馬神經元(見圖1A)，并對神經元采用NSE免疫熒光染色后，在熒光顯微鏡下可觀察到其胞質和樹突著紅色熒光，胞核著藍色熒光。結果(見圖1B)所示，在熒光顯微鏡下隨機選取10個視野觀察并計數，計算其均數得神經元純度在95%以上。

A：體外原代培養海馬神經元；B：NSE染色海馬神經元

2.2 癲癇海馬神經元CHOP、HSP60和ClpP表達變化 與對照組相比，AE組(3 h、12 h、24 h)CHOP和HSP60蛋白的表達量均顯著增多，且在12 h內，CHOP表達量與時間呈正相關，12 h后有所下降。與對照組相比，AE組(3 h、12 h、24 h)ClpP蛋白的表達量均顯著增加，且與時間呈正相關。差異具有統計學意義(P<0.05，見圖2)。

圖2 癲癇海馬神經元CHOP、HSP60和ClpP表達變化

2.3 Mdivi-1對線粒體未折疊蛋白反應的影響 與AE組相比，Mdivi-1使海馬神經元CHOP、HSP60和ClpP的表達量增加，差異有統計學意義(P<0.05，見圖3)。與AE組相比，DMSO組(陰性對照組)CHOP、HSP60和ClpP表達量無顯著差異(P>0.05，見圖3)。

圖3 Mdivi-1對海馬神經元CHOP、HSP60和ClpP表達變化的影響

2.4 Mdivi-1對海馬神經元線粒體ROS生成及線粒體膜電位影響 與對照組相比，AE組海馬神經元線粒體ROS生成增多以及線粒體膜電位降低(P<0.05，見圖4)。與AE組相比，Mdivi-1使海馬神經元線粒體ROS生成顯著減少，線粒體膜電位增加(P<0.05，見圖4)。與AE組相比，DMSO組海馬神經元線粒體ROS生成及線粒體膜電位無顯著差異(P>0.05，見圖4)。

圖4 A：各組海馬神經元線粒體ROS生成變化；B：各組海馬神經元線粒體膜電位變化

2.5 Mdivi-1對海馬神經元CytC水平及caspase-3激活的影響 與對照組相比，AE組海馬神經元cyto-CytC水平升高并且caspase-3激活增加，而mito-CytC水平降低(P<0.05，見圖5)。與AE組相比，Mdivi-1使海馬神經元cyto-CytC水平降低且caspase-3激活減弱，而mito-CytC水平升高(P<0.05，見圖5)。AE組和DMSO組海馬神經元CytC水平及caspase-3激活無顯著差異(P>0.05，見圖5)。

圖5 各組海馬神經元CytC水平及caspase-3激活變化

3 討 論

本研究證實癲癇海馬神經元中線粒體未折疊蛋白反應增強，并且線粒體自噬抑制劑Mdivi-1可以通過增強線粒體未折疊蛋白反應對癲癇海馬神經元發揮保護作用。進一步研究發現Mdivi-1可以減少線粒體ROS生成以及恢復線粒體膜電位，并且Mdivi-1通過減少CytC釋放和caspase-3的激活從而減少海馬神經元凋亡，這些研究發現為癲癇治療提供了新思路。

線粒體蛋白正確折疊和轉運對維持線粒體功能至關重要[8,9]。研究表明癲癇發作可引起線粒體氧化呼吸鏈損傷，ROS水平上升，ATP水平下降，線粒體跨膜電位下降及Ca2+紊亂等線粒體功能障礙[10]。另外研究發現線粒體氧化應激會降低線粒體導入效率，從而導致線粒體蛋白質量控制失衡，并且大量ROS會干擾線粒體蛋白質折疊環境從而觸發mtUPR[11,12]。研究表明在應激環境下HSP60水平升高能促進線粒體蛋白質高效折疊，其主要折疊相對較小的，可溶性的單體蛋白[13,14]。而CLpP能識別錯誤折疊的蛋白并將其降解為8～20個氨基酸的多肽[15]。本研究結果顯示癲癇海馬神經元較對照組CHOP、HSP60和CLpP表達量顯著增加，提示癲癇海馬神經元mtUPR被激活，并可通過mtUPR恢復線粒體蛋白質穩態和維持線粒體正常功能。

線粒體受損時，除了mtUPR被激活，PINK1介導的線粒體自噬途徑也被激活[16]。研究表明當線粒體導入效率輕微受損即可激活mtUPR，而PINK1需要在線粒體外膜上大量積累才可激活線粒體自噬[17,18]。這提示線粒體損傷較輕時，優先激活mtUPR來恢復線粒體功能。當線粒體損傷較重時，線粒體自噬相關的PINK1和Parkin與HSP60互動關閉mtUPR，并激活線粒體自噬，清除受損嚴重的線粒體。本研究發現粒體自噬抑制劑Mdivi-1可增加癲癇海馬神經元CHOP、HSP60和CLpP表達量，使線粒體ROS生成減少、線粒體膜電位恢復，并減少CytC釋放和caspase-3激活，提示抑制線粒體自噬可通過增強mtUPR來使過度受損的線粒體恢復正常功能，并且進一步減少海馬神經元凋亡。

綜上所述，在無鎂外液致癇海馬神經元中mtUPR被激活，并且線粒體自噬抑制劑Mdivi-1可通過增強mtUPR發揮癲癇神經保護作用，其機制可能是通過減少線粒體ROS生成、恢復線粒體膜電位及減少CytC釋放和caspase-3激活發揮神經保護作用，這也表明mtUPR有望成為癲癇治療的新靶點。