早發性卵巢功能不全患者中SIRT1與氧化應激的相關性研究

郭路，劉曉程，馬淼，楊航，陳秀英，李斌，顧超

1.復旦大學附屬婦產科醫院婦科，上海200011；2.上海市女性生殖內分泌相關疾病重點實驗室，上海200090；3.復旦大學上海醫學院，上海200032

隨著人們對生活質量的追求越來越高，卵巢功能的保護以及其衰老的延緩越來越受到女性們的關注。近年來，早發性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI) 也稱為卵巢早衰，發病率逐年升高，嚴重危害女性健康。POI 病因復雜多樣，發生機制尚不明確。氧化應激相關基因在卵巢衰老過程中發揮著重要作用，可能參與始基卵泡生成、卵泡生長、成熟及閉鎖等過程，進而參與POI 致病進程。組蛋白去乙酰化酶（Sirtuin1，SIRT1）是1 種去乙酰化酶，參與應激防御和抗衰老相關酶的表達，在氧化應激中的作用已得到共識[1]。本研究擬檢測POI 患者血清氧化應激及SIRT1 水平變化，探索POI 患者血清氧化應激水平與SIRT1 的關系，并進一步在細胞水平檢測氧化應激對人卵巢顆粒細胞功能的影響，為干預POI提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2019年6月—2020年6月在復旦大學附屬婦產科醫院門診就診的患者90 例，根據血清促卵泡激素（follicle-stimulating hormone，FSH）水平分為正常對照組（A 組，FSH<10U/L，n=30）和POI 組，POI 組再分為2 個亞組：B 亞組（25U/L40U/L，n=30）。本課題資料收集已獲得我院倫理委員會同意并批準（審批號：2019-106）。

1.2 納入和排除標準 納入標準：患者年齡<40 歲；無化療、放療、自身免疫性疾病、卵巢原發或轉移腫瘤、盆腔及卵巢炎癥性疾病、盆腔或卵巢手術史；無生殖相關家族病史；至少3 個月內未使用過激素類藥物；正常對照組患者，平素月經規律，經量正常，未絕經，血FSH<10U/L；POI 患者組患者月經稀發或閉經，血FSH>25U/L；自愿參與本課題研究并簽署知情同意書。排除標準：患者年齡≥40 歲；有化療、放療、自身免疫性疾病、卵巢原發或轉移腫瘤、盆腔及卵巢炎癥性疾病、盆腔或卵巢手術史；生殖相關家族病史；3 個月內使用過激素類藥物。

1.3 檢測指標與方法 晨起采外周全血后30 min 內離心，取上層血清，置于-80℃凍存，并收集臨床基本資料[2]。（1）超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、SIRT1活性及SIRT1 含量檢測：全血收集后4℃離心10 min，取上清，酶聯免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測相應指標的水平。（2）人卵巢顆粒細胞瘤細胞KGN 凋亡檢測：前1 d 將KGN 細胞用6 孔板鋪板（5×105/孔），取不同濃度的H2O2（0、50、100、200mol/L）干預24 h，篩選最佳濃度，建立氧化應激損傷KGN 模型[3]。胰酶消化，4℃離心5 min，1000 g，加入5L 的Annexin V-PE 及5l 7-AAD，避光孵育15 min，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡。（3）活性氧（reactive oxygen species，ROS）活性檢測：每孔加入20mol/L 的DCFH-DA 工作液1 mL，37 ℃細胞培養箱內避光60 min，流式細胞儀檢測ROS 活性；（4）線粒體膜電位（Mitochondrial membrane potential，MMP）檢測：加入羅丹明123染液10g/mL，37 ℃細胞培養箱孵育30 min，流式細胞儀檢測MMP 水平。（5）E2和AMH 檢測：收集正常對照組與氧化應激損傷KGN模型組細胞上清液，4℃離心10min，取上清，ELISA 檢測E2和AMH 濃度。

1.4 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測 檢測細胞中SIRT1、抗繆勒管激素2 型受體（anti-mullerian hormone type 2 receptor，AMHR2）、促卵泡激素受體（follicle-stimulating hormone receptor，FSHR）、黃體生成素受體（luteinizing hormone receptor ，LHR）表達水平：采用100mol/L 的H2O2干預KGN24h 后，制備蛋白樣品，BCA 測定蛋白濃度，25g 蛋白樣品上樣，60 V 濃縮膠，120 V 分離膠電泳，330 mA 恒電流轉膜90min，牛奶封閉60min。一抗稀釋液（SIRT1，1∶2000；FSHR，1∶2000；AMHR2，1∶2000；LHR，1∶2000）4℃孵育過夜。搖床室溫孵育二抗1 h，發光儀曝光。

1.5 統計學分析 采用SPSS 21.0 軟件進行數據分析。連續性計量資料采用均數±標準差（±s）表示，數據符合正態分布，方差齊，用單因素方差分析，并進一步通過LSD 進行組間比較，若方差不齊，用非參數檢驗。符合正態分布的數據運用Pearson 相關分析，不符合正態分布的數據行Spearman相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3 組基線資料比較A 組患者年齡為17～39 歲，平均年齡為（29.1±6.5）歲，平均體質量指數(BMI) 為（22.08±3.17）kg/m2，其中2 例患者有吸煙史；B 亞組患者年齡為18～39 歲，平均年齡為（31.3±5.4）歲，平均BMI 為（22.65±3.18）kg/m2，其中3 例患者有吸煙史；C 亞組患者年齡為21～39 歲，平均年齡為（30.6±4.7）歲，平均BMI 為（23.05±2.90）kg/m2，其中2 例患者有吸煙史。3 組患者均無手術及腫瘤史。3組患者在年齡、BMI、吸煙、手術及腫瘤史等方面的差異均無統計學（P>0.05）。

2.2 3 組血清氧化應激水平及SIRT1 水平及活性比較C 亞組血清SOD 活性較A 和組B 亞組顯著下降，B亞組與A 組血清SOD 活性差異無統計學意義（P>0.05）；B 亞組和C 亞組血清GSH-Px 活性降低，但是B 亞組與C 亞組差異無統計學意義（P>0.05）；C 亞組血清MDA 活性升高。B 亞組和C 亞組血清SIRT1 水平及活性下降，并且C 亞組血清SIRT1 活性明顯低于B 亞組。結果 表明POI 患者體內氧化應激水平明顯改變，并且隨著卵巢功能顯著下降，改變更加明顯；血清SIRT1 含量及活性也顯著下降。見圖1。

2.3 POI 患者血清氧化應激水平與SIRT1 相關性分析血清SOD 活性與血清SIRT1 含量及活性呈正相關（r=0.36，P=0.0005；r=0.22，P=0.04），血清GSH-Px活性與血清SIRT1 含量及活性正相關（r=0.36，P=0.0006；r=0.30，P=0.004）,血清MDA 活性與血清SIRT1 含量及活性負相關（r=-0.49，P<0.0001；r=-0.24，P=0.02）。見圖2。

2.4 氧化應激對卵巢顆粒細胞功能影響 H2O2干預的KGN 細胞組ROS 水平升高，MMP 水平降低，細胞凋亡增加，其中，100mol/L 的H2O2干預組最為顯著。因此，最終選擇100mol/L 的H2O2為最終造模濃度。Western Blot 結果顯示氧化應激損傷KGN 細胞模型組SIRT1 表達水平顯著降低，顆粒細胞表面功能性受體FSHR、AMHR2、LHR 表達明顯下降，同時雌二醇（estradiol，E2）、抗繆勒管激素（Anti-mullerian hormone，AMH）合成及分泌能力降低。結果 說明氧化應激可能通過SIRT1 參與調控顆粒細胞表面受體表達及激素合成能力，影響顆粒細胞成熟、生長及發育，進而影響卵巢功能。見圖3～4。

3 討論

早發性卵巢功能不全（即卵巢早衰）病因復雜，常見病因包括遺傳因素、醫源性因素(如手術、放化療和藥物損傷)、免疫因素(如自身免疫性甲狀腺疾病、Addison 病)以及環境因素等，但臨床上仍有50%以上的POI 患者病因不明確，目前尚無有效的治療方法[4]。2020年劉光慧等[5]通過單細胞測序發現在卵巢衰老過程中卵母細胞及顆粒細胞氧化損傷增加，伴隨著促凋亡基因表達上調、氧化還原酶相關基因表達下調，并且發現氧化應激相關轉錄因子在卵泡發育不同階段中起著重要作用。始基卵泡的閉鎖或消耗過速，卵巢儲備功能耗竭，是POI 發生發展的病理生理轉歸，可能與氧化應激等原因造成的卵巢直接損傷，血管減少，間質纖維化，卵泡發育信號通路失衡等有關，具體機制尚不明確[6-9]。因此，研究POI 的病因及其發生機制對于臨床上POI 的治療具有至關重要的意義。

圖1 3 組血清氧化應激水平及SIRT1 水平及活性比較

圖2 POI 患者氧化應激水平與SIRT1 相關性分析

本實驗發現，POI 患者血清SOD、GSH-Px 活性下降，MDA 活性上升，并且隨著POI 患者卵巢功能下降，血清SOD、GSH-Px 活性下降更加顯著，MDA活性上升更加顯著，說明POI 的發生與氧化應激相關，并且POI 疾病嚴重程度與氧化應激損傷程度相關。此外，POI 患者血清SIRT1 水平降低，SIRT1 活性下降，進一步研究發現血清SOD 活性、GSH-Px 活性與血清SIRT1 含量及活性呈正相關，MDA 活性與血清SIRT1 含量及活性呈負相關。SIRT1 作為線粒體動力學的調節因子，多項研究提示SIRT1 參與氧化應激過程，在胰島素抵抗、非酒精性脂肪肝性疾病、神經退化性疾病研究中，激活SIRT1 信號通路可以減少脂多糖誘導的ROS 生成，而SIRT1 抑制劑可抑制這種保護作用[10-12]。SIRT1 水平的高低在一定程度上可以反映血清氧化應激水平狀態，進一步說明氧化應激參與POI 致病過程。

圖3 氧化應激損傷KGN 模型建立

圖4 氧化應激影響卵巢顆粒細胞功能

本研究的細胞實驗發現，氧化應激損傷KGN 細胞中SIRT1 表達降低，顆粒細胞表面功能性受體FSHR、LHR 及AMHR2 表達降低，顆粒細胞E2 及AMH 合成及分泌能力降低，SIRT1 對卵巢顆粒細胞發育及功能具有重要調控作用，氧化應激可能通過SIRT1 影響顆粒細胞功能參與POI 的發生過程。FOXOL2基因在卵巢的分化維持及功能中具有重要作用，FOXOL2 突變表現為人瞼裂狹小綜合征，I 型患者伴有卵巢功能不全。氧化應激狀態下，顆粒細胞內FOXL2表達激活，可誘導下游FOXO 信號轉導，促進卵巢分化相關基因表達，同時促進SIRT1 表達升高，負反饋調控FOXL2 的表達[13]。FOXL2 表達過度激活可導致顆粒細胞功能損傷，激素分泌減少，排卵障礙，從而導致POI 的發生發展[14]。抗氧化劑褪黑素通過激活SIRT1 表達，促進PI3K-AKT 通路介導的FOXO1 去乙酰化修飾，抑制氧化應激誘導的卵巢顆粒細胞自噬，提示SIRT1 可能是抗氧化應激作用改善POI 小鼠卵巢功能的潛在作用靶點[15]。

綜上所述，氧化應激可能通過SIRT1 參與POI發生，改善低雌激素狀態及維持卵泡發育及功能，由于SIRT1 廣泛表達于人體各個組織中，SIRT1 與多種信號傳導通路相互作用，參與神經保護、細胞衰老調控、糖脂代謝及炎癥免疫等過程。SIRT1 相關信號通路研究有助于探索POI 發生機制，但其應用于POI治療仍需進一步的實驗研究。但是本實驗存在一定的局限性，首先，外周血中的氧化應激及SIRT1 水平影響因素很多，外周血不能代表卵巢組織中的氧化應激狀態及SIRT1 變化，卵泡液在一定程度上更能反應卵巢氧化應激狀態，后續將從生殖中心收集POI 患者取卵時的廢棄卵泡液；其次，由于倫理學限制以及人顆粒細胞來源困難，實驗采用KGN 細胞系，KGN 來自于人卵巢顆粒細胞瘤，并不是真正的原代細胞，不能準確評價氧化應激功能，后續將增加正常人群黃素化顆粒細胞的培養及相應的分子實驗；此外，H2O2處理的KGN 細胞不能代替POI，后續仍需進一步動物試驗驗證氧化劑是否能引起小鼠POI 表型改變，線粒體作為氧化應激發生的主要場所，而SIRT1 在細胞核表達，其如何調控線粒體分子，具體作用機制如何，這些問題仍需后續的實驗研究來闡明。