有氧運(yùn)動(dòng)通過(guò)SIRT1/NF-ΚB信號(hào)通路改善睡眠剝奪大鼠的學(xué)習(xí)記憶

葉南，邵玉萍

1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，老年醫(yī)學(xué)研究所，湖北武漢430065；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)體育健康學(xué)院，湖北武漢430065

有氧運(yùn)動(dòng)作為一種簡(jiǎn)單方便的預(yù)防性手段，能有效改善認(rèn)知障礙患者和健康人群的認(rèn)知功能和學(xué)習(xí)記憶能力[1-2]，能增強(qiáng)海馬的增殖能力、提高神經(jīng)可塑性和改善神經(jīng)炎癥。研究表明，老年人進(jìn)行規(guī)律長(zhǎng)期的有氧運(yùn)動(dòng)能改善其認(rèn)知功能，降低老年癡呆的風(fēng)險(xiǎn)。阿爾茲海默癥（Alzheimer's disease,AD）是以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙為特征的一種老年癡呆，會(huì)引起神經(jīng)炎癥和突觸丟失，是臨床最常見的一種慢性神經(jīng)退行性疾病[3]。有氧運(yùn)動(dòng)[4]能顯著改善AD 患者的認(rèn)知功能，延緩相關(guān)的認(rèn)知功能衰退。睡眠障礙會(huì)損壞海馬記憶的形成和鞏固，誘發(fā)免疫炎癥反應(yīng)，對(duì)認(rèn)知功能和整體健康有不良影響[5]。研究表明，4 周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可預(yù)防急性睡眠剝奪引起的炎癥反應(yīng)及學(xué)習(xí)記憶的損傷[6]，逆轉(zhuǎn)由睡眠剝奪引起的認(rèn)知功能下降[7]，故本實(shí)驗(yàn)采用有氧運(yùn)動(dòng)作為干預(yù)方式。

在炎癥反應(yīng)中，沉默信息因子2 相關(guān)酶1（silent mating type information regulation 2 homolog1，SIRT1）/核因子B (nuclear factor-kappa-B,NF-ΚB)信號(hào)通路起到關(guān)鍵作用[8]，SIRT1 可通過(guò)抑制NF-ΚB信號(hào)降低炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)炎癥因子TNF-α 、IL-6 的表達(dá)，發(fā)揮保護(hù)學(xué)習(xí)記憶的作用。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建睡眠剝奪模型并給予運(yùn)動(dòng)預(yù)干預(yù)，探究SIRT1/NFB 信號(hào)通路及相關(guān)炎癥因子調(diào)節(jié)睡眠剝奪引起的炎癥反應(yīng)的具體作用機(jī)制，為有氧運(yùn)動(dòng)防治認(rèn)知功能及學(xué)習(xí)記憶損傷提供一定的理論和研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及處理 SPF 級(jí)2月齡雄性SD 大鼠40只，體重180±20 g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，許可證號(hào)：SCXK (鄂) 2015-001。將40 只大鼠隨機(jī)分成空白對(duì)照組（CON）、完全睡眠剝奪組（TSD）、有氧運(yùn)動(dòng)組（EX）和運(yùn)動(dòng)+完全睡眠剝奪組（EX+TSD），每組10 只。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，自由飲食，自然光照。

1.2 試劑及儀器Trizol，Ambion；HiScript Reverse Transcriptase (RNase H)、5×HiScript Buffer，VAZYME；SYBR Green Master Mix,VAZYME；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒。自制睡眠剝奪箱，Morris 水迷宮，QuantStudio 6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，Nano-100微量分光光度計(jì)，EDC-810 PCR 儀，DYCZ-24DN 垂直電泳槽,DG-3022A 酶標(biāo)儀,HI650 離心機(jī)。

1.3 運(yùn)動(dòng)方案采用跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)方案[9]，使用計(jì)算機(jī)控制的六道動(dòng)物跑臺(tái)，為減少非特異性應(yīng)激反應(yīng)，正式訓(xùn)練前EX 組及EX+TSD 組進(jìn)行3 d 適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練，每天訓(xùn)練10 min。正式跑臺(tái)訓(xùn)練時(shí)間為4 周，跑臺(tái)坡度保持為0°，速度均為15 m/min，第1 周和第2 周每天進(jìn)行30 min的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，第3 周每天進(jìn)行45 min的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，第4 周每天進(jìn)行60 min 的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，每運(yùn)動(dòng)15 min 后休息5 min。

1.4 模型建立在跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)結(jié)束之后的第2 天，TSD 組、EX+TSD 組的大鼠采用多平臺(tái)水環(huán)境法進(jìn)行72 h 的連續(xù)睡眠剝奪，建立大鼠完全睡眠剝奪模型。自制睡眠剝奪鼠箱（70 厘米×50 厘米×30 厘米），將連體并且呈2×3 排列的圓形小平臺(tái)(高8.0 厘米，直徑7.0 厘米) 置于睡眠剝奪箱內(nèi)，箱內(nèi)注水至水位在圓形平臺(tái)以上1 厘米。大鼠進(jìn)入快速眼動(dòng)睡眠階段后，會(huì)因?yàn)楣趋兰〉膹埩ο陆担鸫笫笥|落入水而驚醒。在正式睡眠剝奪實(shí)驗(yàn)開始前，需讓大鼠適應(yīng)小平臺(tái)3 d，每天進(jìn)行1 h。

1.5 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)結(jié)束1 d 后開始Morris 水迷宮測(cè)試,Morris 水迷宮分為空間探索實(shí)驗(yàn)以及定位航行實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)設(shè)備由圓形水池（直徑100 厘米，高80 厘米）、可移動(dòng)大鼠站臺(tái)(直徑10 厘米，高30 厘米)、影像收集及分析系統(tǒng)等部分組成。實(shí)驗(yàn)時(shí)圓池水面需沒(méi)過(guò)大鼠站臺(tái)1-2 厘米，水池分成4 個(gè)象限，將站臺(tái)放入第一象限定為目標(biāo)象限。Morris 水迷宮共進(jìn)行7d，前5 d 為空間探索實(shí)驗(yàn),將大鼠從第三象限的中間點(diǎn)面朝著水池的池壁放入到水池中，如果大鼠在60 秒的時(shí)間內(nèi)未找到站臺(tái)，則將大鼠引到站臺(tái)上停留10 s，統(tǒng)計(jì)大鼠上平臺(tái)潛伏期，游泳總路程。第6 天休息,第7 天撤取平臺(tái)后開始定位航行實(shí)驗(yàn),記錄大鼠60s 內(nèi)初次抵達(dá)平臺(tái)時(shí)間和目標(biāo)象限停留時(shí)間，評(píng)價(jià)睡眠剝奪和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響。

1.6 動(dòng)物取材及處理 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后，將大鼠麻醉處死，放置在冰上迅速剝離大腦，取出海馬，置于做好標(biāo)記的凍存管中，置于-80℃冰箱中保存。

1.7 Real-Time PCR 檢測(cè)TNF-α 和IL-6mRNA 的表達(dá)水平 取出海馬組織置于勻漿器中，用Trizol 法提取海馬總RNA，然后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，將總mRNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后進(jìn)行擴(kuò)增，具體實(shí)驗(yàn)步驟參照試劑盒的說(shuō)明書。RT-PCR 擴(kuò)增條件為:95℃15 s，60℃60 s，95℃15s，共進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)，于65～95℃繪制溶解曲線，采用2-△△Ct值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。使用HiScript Reverse Transcriptase (RNase H)（VAZYME，中國(guó)）和SYBR Green Master Mix（VAZYME，中國(guó)）試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和qPCR 反應(yīng)。引物序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度見表1。

1.8 Western-Blotting 法檢測(cè)海馬SIRT1 和Ac-NF-ΚB P65 蛋白表達(dá)水平 取大鼠海馬組織裂解液置于自動(dòng)勻漿機(jī)中進(jìn)行裂解研磨后，提取海馬總蛋白，蛋白濃度的測(cè)定采取BCA 法。將提取的蛋白上清與5×上樣緩沖液混合后進(jìn)行沸水浴，變性完成后冷卻至室溫放入-80℃保存?zhèn)溆谩Ｖ苽浞蛛x膠和濃縮膠，將制備好的蛋白樣品加入到上樣孔中進(jìn)行電泳至溴酚藍(lán)到凝膠底部。電泳結(jié)束后取出凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完成后用含5% 脫脂奶粉的TBST（封閉液）浸泡PVDF 膜，室溫?fù)u床封閉2 h，一抗兔抗GAPDH (1∶1000)、鼠抗P65（1∶1000）、兔抗ac-p65（1∶1000）、兔抗Sirt1（1∶1000）4℃孵育過(guò)夜，充分洗膜，二抗（1∶50000）室溫?fù)u床孵育2h，洗膜5 次。使用ECL試劑化學(xué)顯色拍照。

1.9 免疫熒光染色 檢測(cè)海馬中SYN 和PSD95 蛋白表達(dá)水平海馬組織爬片用4%多聚甲醛固定，取出切片入PBS 浸泡，山羊血清封閉，加入一抗兔抗PSD95（1∶200）和兔抗SYN（1∶200），4℃孵育過(guò)夜，PBS沖洗3 次后加入熒光二抗（1∶100）37℃孵育1 h，再用PBS 沖洗4 次，滴加DAPI 復(fù)染細(xì)胞核避光孵育5 min，PBS 洗去多余的DAPI，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，在熒光顯微鏡下采集圖像。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)與方差齊性檢驗(yàn)后，正態(tài)分布且方差齊性的計(jì)量資料，2 組間比較行獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)睡眠剝奪模型大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)的影響與CON 組比較，TSD 組大鼠的上平臺(tái)潛伏期和游泳總路程延長(zhǎng)（P<0.05）；與TSD 組比較，EX+TSD組和EX 組上平臺(tái)潛伏期減少（P<0.05），游泳總路程顯著減少（P<0.01）。見圖1。

2.2 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)睡眠剝奪模型大鼠空間探查實(shí)驗(yàn)的影響與CON 組比較，TSD 組大鼠目標(biāo)象限停留時(shí)間減少（P<0.05），初次抵達(dá)平臺(tái)時(shí)間顯著延長(zhǎng)（P<0.01）；與TSD 組比較，EX+TSD 組和EX 組大鼠目標(biāo)象限停留時(shí)間顯著增加（P<0.01），初次抵達(dá)平臺(tái)時(shí)間減少（P<0.05）。見圖2。

2.3 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)炎癥因子TNF-α 、IL-6mRNA 表達(dá)的影響與CON 組相比，TSD 組促炎因子TNF-α 、IL-6表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.01）；與TSD 組相比，EX+TSD組促炎因子TNF-α 和IL-6 表達(dá)下調(diào)（P<0.05），EX組促炎因子TNF-α 、IL-6 表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.01）。見圖3。

2.4 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)SIRT1、Ac-NF-ΚB P65 蛋白表達(dá)的影響與CON 組相比，TSD 組SIRT1 蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.01），Ac-NF-ΚB P65蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01）；與 TSD 組相比，EX+TSD 組 SIRT1 表達(dá)升高（P<0.05），Ac-NF-ΚB P65 蛋白表達(dá)下調(diào)（P<0.05），EX 組SIRT1 表達(dá)顯著升高（P<0.01），Ac-NF-ΚB P65蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.01）。見圖4和圖5。

表1 引物序列

圖1 定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖3 大鼠海馬中TNF-α 、IL-6mRNA 表達(dá)含量

圖4 大鼠海馬SIRT1、Ac-NF-ΚB P65 蛋白表達(dá)電泳

2.5 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)PSD95、SYN 標(biāo)記熒光蛋白表達(dá)的影響圖中顯紅色為標(biāo)記蛋白，藍(lán)色為細(xì)胞核。與CON組相比，TSD 組大鼠海馬中PSD95、SYN 的蛋白表達(dá)量降低，與TSD 組比較，EX 組和EX+TSD 組大鼠海馬中PSD95、SYN 的蛋白表達(dá)量增加，見圖6。

3 討論

圖5 大鼠海馬中SIRT1、Ac-NF-ΚB P65 表達(dá)含量

圖6 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)睡眠剝奪大鼠海馬PSD95、SYN 蛋白表達(dá)的影響（×400）

有氧運(yùn)動(dòng)是以大肌群進(jìn)行中等強(qiáng)度，持續(xù)約0.5 h 以上的一種運(yùn)動(dòng)方式，能增強(qiáng)機(jī)體代謝能力，提高大腦血流量，改善心肺功能等，是降低認(rèn)知功能損傷，預(yù)防和改善AD 有效手段[10]。經(jīng)常運(yùn)動(dòng)的老年人患AD 的風(fēng)險(xiǎn)比不常運(yùn)動(dòng)的低40%[11]。認(rèn)知功能屬于海馬的高級(jí)功能，海馬是與認(rèn)知功能和情緒調(diào)節(jié)相關(guān)的重要腦區(qū)，也是晝夜節(jié)律和學(xué)習(xí)記憶的整合體。睡眠影響學(xué)習(xí)與記憶的獲取及回憶，但睡眠與海馬神經(jīng)發(fā)生及學(xué)習(xí)記憶之間的關(guān)系尚未完全明了。本研究發(fā)現(xiàn)，TSD 組大鼠的上平臺(tái)潛伏期、游泳總路程、初次抵達(dá)平臺(tái)時(shí)間顯著延長(zhǎng)，目標(biāo)象限停留時(shí)間顯著減少，表明睡眠剝奪會(huì)損傷大鼠的學(xué)習(xí)記憶。而經(jīng)有氧運(yùn)動(dòng)預(yù)干預(yù)的EX+TSD 組、EX 組大鼠的上平臺(tái)潛伏期、游泳總路程、初次抵達(dá)平臺(tái)時(shí)間減少，目標(biāo)象限停留時(shí)間顯著增加，表明有氧運(yùn)動(dòng)能提高睡眠剝奪大鼠的學(xué)習(xí)記憶。

睡眠對(duì)認(rèn)知功能健康非常重要，睡眠剝奪會(huì)引發(fā)炎癥反應(yīng)。TNF-α 、IL-6 是衡量炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵指標(biāo)，TNF-α 能誘導(dǎo)炎癥因子IL-6 的產(chǎn)生和釋放并加強(qiáng)炎癥反應(yīng)[12]，本研究表明，TSD 組促炎因子TNF-α 、IL-6 mRNA 表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.01），說(shuō)明睡眠剝奪會(huì)促使促炎因子TNF-α 和IL-6 的分泌，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。而經(jīng)有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后EX+TSD 組TNF-α 、IL-6表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明有氧運(yùn)動(dòng)能調(diào)控炎癥因子TNF-α 和IL-6 的含量變化，在一定程度上預(yù)防和改善睡眠剝奪引起的學(xué)習(xí)記憶的損傷及炎癥反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)睡眠剝奪引起的短時(shí)記憶損傷。

睡眠剝奪會(huì)誘發(fā)炎癥反應(yīng)，NF-ΚB 抑制因子I B 的磷酸化會(huì)促使NF-ΚB 轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，激活炎癥反應(yīng)。NF-ΚB 是TNF-α 、IL-6 等炎癥基因的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，NF-ΚBp65 賴氨酸位點(diǎn)K310 乙酰化能重點(diǎn)增強(qiáng)p65 與DNA 的結(jié)合能力，提高其轉(zhuǎn)錄激活的功能。NF-ΚB 的活化會(huì)促生炎性細(xì)胞因子，影響SIRT1 的活性。SIRT1 可直接作用于NF-ΚB 的p65亞單位，下調(diào)p65 的乙酰化程度，抑制I B 磷酸化和下游炎性因子IL-6、TNF-α 的轉(zhuǎn)錄[13]，防止炎癥引起的神經(jīng)元損傷[14]，減輕炎癥反應(yīng)。SIRT1 通過(guò)NFB 脫乙酰化產(chǎn)生抗炎作用，能預(yù)防NF-ΚB 的核易位和促炎基因的表達(dá)[15]。本研究表明，TSD 組SIRT1蛋白表達(dá)顯著降低，Ac-NF-ΚB P65 表達(dá)顯著升高，說(shuō)明睡眠剝奪引起了炎癥反應(yīng)的發(fā)生；而EX+TSD 組海馬中SIRT1 表達(dá)上調(diào)，Ac-NF-ΚB P65 的表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明有氧運(yùn)動(dòng)能促使SIRT1 活化，促進(jìn)NF-ΚB P65脫乙酰化，減少Ac-NF-ΚB P65 和促炎因子的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控炎癥過(guò)程，改善睡眠剝奪引起的大鼠學(xué)習(xí)記憶損傷。

突觸的可塑性是海馬學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)。突觸素( synaptophysin，SYN) 位于突觸前膜，是突觸前終末的特異性標(biāo)志物，可間接反映突觸密度和分布，主要調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。突觸后致密蛋白PSD95 位于突觸后膜，是信息傳遞和記憶形成的主要場(chǎng)所，能維持突觸的功能和形態(tài)。有研究采用免疫熒光對(duì)標(biāo)志性蛋白PSD95 和SYN 進(jìn)行檢測(cè)，觀察突觸的功能損傷情況，發(fā)現(xiàn)有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)能夠使SYP、PSD-95 的表達(dá)上調(diào)，改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[16]。本實(shí)驗(yàn)表明，TSD 組大鼠海馬中PSD95、SYN 的蛋白表達(dá)量降低，說(shuō)明睡眠剝奪會(huì)造成一定的突觸損傷，而EX+TSD 組大鼠海馬中PSD95、SYN 的蛋白表達(dá)量增加，說(shuō)明有氧運(yùn)動(dòng)能改善睡眠剝奪引起的海馬突觸損傷。睡眠和記憶屬于大腦基本的生理功能，可見，良好的睡眠能增強(qiáng)突觸可塑性，有助于學(xué)習(xí)記憶能力[17]。

綜上，睡眠剝奪能損傷學(xué)習(xí)記憶，而4 周的有氧運(yùn)動(dòng)能有效改善這種損傷，其機(jī)制可能通過(guò)調(diào)節(jié)SIRT1/NF-ΚB 信號(hào)通路及相關(guān)炎性因子的含量，改善由睡眠剝奪引起的大鼠學(xué)習(xí)記憶損傷。