miR-365抑制TGF-β誘導的人肺癌細胞上皮-間質轉化

王玉娜,茍德明，侯玲,康康，劉紅梅

1.寧夏醫科大學基礎醫學院，寧夏銀川750004；2.深圳大學生命與海洋科學學院，廣東深圳518060；3.深圳大學醫學部基礎醫學系，廣東深圳518060

肺癌被認為是一種老年性癌癥，據統計，中國男性癌癥患者中肺癌患者約占21%，隨著年齡的增長，其發病率和死亡率都不斷增高，老年患者比例超過了三分之二[1,2]。上皮-間質轉化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT) 是指在某些特定的生理或病理情況下上皮型細胞向間質型細胞表型轉變的過程[3]。已有的研究表明，TGF-β、Notch、NF-ΚB 等信號通路均可誘導EMT 發生。microRNA 的異常表達在腫瘤的發生發展如增殖、凋亡過程中起著重要作用[4]。研究發現miR-491 通過下調 B-crystallin 的表達從而抑制膠質母細胞瘤細胞的EMT 過程[5]。另有研究發現在人肺癌細胞系中，miR-23a 與EMT 密切相關[6]。已有報道證明miR-365 在腫瘤發展過程中異常表達[7]，如它通過靶向下調E2F2 基因從而抑制胃癌細胞的增殖[8]。但miR-365 在EMT 發生發展過程中的變化及作用報道很少，本研究初步探討了miR-365 在TGF-誘導的人肺癌A549 細胞EMT過程中的變化和作用。這對早期預防和治療由EMT 引發的肺癌提供了新的思路和方向，同時也為降低老年人患肺癌的概率找到了新突破口。

1 材料與方法

1.1 試劑 重組人TGF-β購自Sigma-Aldrich 公司；PEI 轉染試劑購自Polysciences,inc.America；構建miR-365 過表達載體時的PCR 引物由生工生物（上海）股份有限公司合成；E-cadherin 及-actin 兔多克隆抗體均購自Sigma-Aldrich 公司。

1.2 細胞培養 人肺癌細胞A549 購自美國模式培養物集存庫(ATCC)。使用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養液培養，培養箱條件為37°C、5%CO2。

1.3 慢病毒包裝及細胞分組處理 構建miR-365 的過表達載體質粒(過表達miR-365 命名為pLVX-miR-365，未過表達miRNA的命名為pLVX-control作為對照。)。用PEI轉染試劑共轉染過表達質粒和病毒包裝質粒于293T 細胞中，48 小時后收取上清液離心凍存備用。

檢測TGF-β刺激A549 細胞產生EMT及miR-365的表達實驗。細胞分為2 組：（1）TGF-β組，加入5 ng/mL TGF-β刺激A549 細胞48 h；（2）對照組，未加入任何試劑，培養A549 細胞48 h。

檢測miR-365 在EMT 發生中的作用實驗。細胞分為4 組：（1）添加miR-365 慢病毒于A549 細胞中；（2）添加對照組慢病毒于A549 細胞中；（3）添加miR-200c 慢病毒（大量文獻表明miR-200c 抑制EMT發生，本文引用miR-200c 作為陽性對照）于A549 細胞中；（4）不添加任何慢病毒的A549 細胞。感染完成后，對miRNA 的過表達進行檢測，并對四組細胞進行5 ng/mL TGF-β刺激。

1.4 熒光定量PCR 檢測A549 細胞中miR-365 的表達分別提取用TGF-β刺激和未經TGF-β刺激的A549 細胞總RNA，對于miRNA 的檢測，采用已經申請專利的熒光定量PCR 法即S-Poly (T) 法。S-Poly (T) 法檢測miRNA 時需要先給RNA 加尾，即加polyA，反應體系：總RNA 1g、A-Plus Buffer 1L、10 mM ATP 1L、Poly (A) Polymerase (4 U/L) 0.25L，補充無RNA 酶的水至反應體系至10L。加尾后的RNA 進行逆轉錄，使其變成cDNA，逆轉錄反應體系：加尾RNA100 ng、RT-primer 1L、5×M-MLV Buffer 2L、RTase M-MLV（RNase H）（200 U/L）0.5L、2 mM dNTP mix 2.5L，補充無RNA 酶的水至反應體系至10L。miR-365 的Real time PCR使用Taqman 探針法，反應體系：5×Colorless GoTaq Reaction Buffer 4L、2 mM dNTP mix 2L、GoTaqDNA Polymerase 0.5 U、10M 3UnivRP 0.4L、10M Probe 0.5L、ROX Reference Dye (50×) 0.4L、cDNA 2L、miRNA primer (1M) 4L，補充反應體系至20L。以snord47 為內參在ABI Stepone Plus Realtime PCR 儀運行程序，miR-365 的表達變化使用2(-CT)計算方法進行計算。實驗重復3 次。

同理使用該方法檢測感染慢病毒之后的A549 細胞中miR-365 和miR-200c是否過表達，以U6 為內參。

1.5 Western blot 方法檢測E-cadherin 蛋白的表達變化感染慢病毒（miR-365 組、miR-200c 組、對照組）和未感染慢病毒（blank）的A549 細胞在未經TGF-刺激和經過TGF-β刺激48 小時后，棄去上清液，使用蛋白質提取試劑盒提取總蛋白，BSA 檢測蛋白濃度。按照蛋白濃度取蛋白，加入適量的6×蛋白質加樣緩沖液于沸水浴中孵育5 分鐘，上樣，SDS-PAGE電泳，轉膜，5%的脫脂奶粉封閉1 小時，加入一抗（anti-E-cadherin 1:1000）4℃過夜,TBST 洗膜3 次，每次5 分鐘，加入二抗1∶10000 室溫下孵育1 個小時，TBST 洗膜4 次，每次5 分鐘。使用ECL 顯色。

1.6 統計學分析 所有實驗均重復3-4 次。對于Western blotting 實驗，僅展示了具有代表性的圖片。數值的表示方式為均數±標準差（±s）。使用GraphPad Prism version 5.0 software 數據分析系統的雙側t 檢驗進行統計學分析。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TGF-β誘導A549 細胞從多角形變為長纖維形 培養人肺癌細胞至對數生長期，加入TGF-β刺激細胞48小時，顯微鏡下觀察A549 細胞形態，隨機選取3 個視野拍照。從圖1可以看出，與對照組（未經TGF-刺激的A549 細胞）相比，TGF-β刺激后的A549 細

圖1 5ng/ml TGF-β處理A549 細胞48 小時后的細胞形態

2.2 TGF-β上調A549 細胞中miR-365 的表達 培養A549 細胞至對數生長期，加入TGF-β刺激細胞48 小時后，分別提取對照組和TGF-β刺激組細胞的RNA，熒光定量PCR 檢測結果顯示：與對照組相比，TGF-刺激組miR-365 的表達明顯升高（圖2）。說明TGF-上調了A549 細胞中miR-365 的表達。

圖2 TGF-β上調A549 細胞中miR-365 的表達

2.3 過表達miR-365 抑制TGF-β誘導A549 細胞的上皮-間質轉化 感染miR-365、miR-200c 和對照慢病毒于A549 細胞中，熒光定量PCR 檢測miR-365 和miR-200c 均有明顯的過表達，如圖3所示，說明過表達miRNA 的穩轉A549 細胞篩選成功。TGF-β刺激穩轉A549 細胞，Western blot 檢測Ecadherin 蛋白（EMT 相關蛋白）的表達變化，如圖4所示，TGF-刺激后，細胞發生EMT，Ecadherin 的表達明顯降低，過表達miR-365 和空白對照及對照組相比，Ecadherin 的表達升高（與陽性對照miR-200c 作用一致），即miR-365 抑制了細胞上皮間質轉化。

圖3 miR-365 和miR-200c 在A549 細胞中過表達

3 討論

圖4 miR-365 對EMT 相關蛋白Ecadherin 表達的影響

上皮間質轉化（EMT）與多種慢性疾病的發生及腫瘤的轉移都有密切關系。大量實驗證明，細胞發生EMT，其遷移能力和抗凋亡能力均增強[9]。近年來，EMT 機制也被認為是上皮來源的惡性腫瘤細胞發生遷移和侵襲的新研究方向[10]，所以研究EMT 的發生機制對于腫瘤的預防和治療有重要的意義。轉化生長因子- （TGF-β）信號通路被廣泛認為是調控EMT過程的信號通路。TGF-β信號介導的EMT 可以通過Smad 通路完成，TGF-β與腫瘤細胞膜上的受體T RI和T RII 結合，激活Smad2 和Smad3，并與Smad4結合進入細胞核,與其他轉錄因子一起介導靶基因的表達，最終使得細胞內的E-cadherin 蛋白低表達[11]，與此同時，Smad 復合物也能誘導miRNA 的表達，本研究初用TGF-β刺激細胞后，發現miR-365 的表達明顯升高，說明該過程的發生有可能是Smad 復合物誘導了miR-365 的表達，本次實驗中還發現TGF-β刺激的細胞形態也發生了明顯變化，帶著疑問我們對EMT相關蛋白E-cadherin 的表達進行了檢測。E-cadherin蛋白主要分布在上皮細胞，貫穿細胞之間的連接，維持著上皮細胞的完整，E-cadherin 異常表達與EMT有直接聯系[12]。

EMT過程是上皮細胞向間質細胞轉移的過程，上皮的可塑性必須由級聯式的轉移做調控，而miRNA被認為是這個級聯轉移反應的關鍵調控因素[13]。大量研究證明miRNA 直接調控E-cadherin 的表達，如在乳腺癌細胞中，miR-9 直接靶向E-cadherin 基因[14]，miR-200c在口腔鱗狀細胞癌中通過抑制EMT的發生從而抑制了腫瘤轉移[15]。miR-200c 是參與EMT 過程最經典的miRNA，已被大量文章報道，所以本實驗將miR-200c 作為陽性對照，從結果可以看出，miR-200c 確實逆轉了EMT 過程，并且效果明顯。參與發生EMT 的信號通路已有大量報道，如經典的TGF-β信號通路，Wnt/ -catenin 信號通路，Notch 信號通路等，但是miRNA 通過與信號通路相互作用參與EMT 過程的報道較少并且不全面，目前相對報道較多的有P53 信號通路，研究發現P53 通過上調miR-34 的表達從而維持細胞的上皮表型[16]，同樣本實驗中TGF-β通過上調miR-365 抑制EMT 發生，通過穩定E-cadherin 的表達維持細胞上皮表型。

目前肺癌的治療除了常規的化療還有免疫治療，對于癌癥患者化療雖起到殺死癌細胞的作用，但是副作用也顯而易見，尤其是老年患者，近幾年免疫治療的效果高于化學療法，并且其對年輕患者和老年患者的效果無明顯差異[17]，所以免疫療法成為治療老年肺癌的首選之一。本研究證明TGF-β上調了肺癌細胞中miR-365 的表達，過表達miR-365 穩定了E-cadherin的表達從而抑制TGF-β誘導的EMT 發生。EMT 被逆轉，癌癥的發生幾率也會明顯降低，所以本研究為肺癌的發生提供了新的研究方向，miR-365 可作為由EMT 引發的肺癌早期預防和治療的一個新指標，同時也將成為老年病的新型診療方法。