腫瘤轉移的“攔路虎”——失巢凋亡的作用機制和調控因子

汪芮萱，楊林，魏立彬

(中國藥科大學，江蘇 南京 210009)

1 介紹

腫瘤的轉移是導致癌癥死亡率升高的主要原因[1,2]，因此深入研究轉移的機制對于開發更有效的腫瘤治療劑至關重要。轉移的完成與一系列復雜的動態過程密切相關：局部浸潤，從原發部位解離，血管浸潤，進入循環系統以及在遠處靶器官增殖形成轉移灶。這整個過程的順利完成離不開腫瘤細胞內各種復雜的信號轉導通路的參與，通過產生遺傳學和/或表觀遺傳學的改變，從而實現進一步的存活和增殖[3]。轉移的發生與患者預后不良，晚期復發以及死亡率升高都密切相關[4]，因此，對于轉移更細致深入的了解，有助于未來探索與改進相關的治療方法。當細胞從細胞外基質(ECM)脫離時，由于營養缺乏、機械損傷、免疫反應等原因往往會觸發一種特殊的凋亡反應，這種凋亡被稱為“失巢凋亡”。本文對于腫瘤轉移過程中失巢凋亡的分子機制以及失巢凋亡抗性的產生的機制和相關靶點進行綜述。

2 失巢凋亡的分子機制

失巢凋亡作為細胞凋亡的一種，是由內源性(線粒體)途徑和外源性(死亡受體)途徑共同調節的[5]。

內源性途徑：當細胞脫離ECM后，由于DNA損傷或者缺氧等反應的發生形成凋亡信號，啟動內源途徑，以維持細胞的完整性和體內內環境的穩態[6,7]。首先，凋亡蛋白Bax和Bak易位到線粒體外膜(Outer mitochondrial membrane，OMM)并在OMM形成寡聚物，使得線粒體的膜電位下降，通透性增強形成一個孔道[8]，線粒體蛋白(如細胞色素C)可以通過該孔道釋放到線粒體外[9-12]。細胞色素C的釋放能夠觸發凋亡蛋白酶激活因子-1(Apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1)介導的caspase-9和caspase-3激活，從而啟動下游蛋白的水解級聯反應，引起細胞凋亡[13]。

外源性途徑：外源性途徑主要通過細胞外死亡配體(例如FASL或TRAIL)調節，當它們結合到細胞表面的受體(例如Fas，TNFR1)上時，引起受體的寡聚化，使得該途徑激活[14]。Fas相關死亡結構域蛋白(Fas associated protein with death domain，FADD)不具有酶的活性，但有兩個結構域，即羧基端的死亡結構域和氨基端的死亡效應結構域(Death effected domain，DED)。FADD的DD可以與Fas分子胞漿段內的DD相結合，其DED則可以連接pro-caspase-8的DED部分，形成死亡誘導信號復合物(Death-inducing signaling complex，DISC)[15]。DISC能夠促進pro-caspase-8進行活性加工，使得活化的caspase-8釋放到細胞質中激活下游caspase-3和caspase-7，啟動下游蛋白水解級聯反應，引起細胞凋亡[14,16]。

3 失巢凋亡抗性的調控機制

3.1 EMT與失巢凋亡抗性

EMT最先由Greenberg和Hay在1982年發現的一種生物過程，在該過程中，上皮極化細胞會經歷各種生化修飾，最終轉化為非極化細胞。許多證據表明，EMT不僅是上皮細胞獲得活動性和侵襲性表型中的關鍵事件，而且還是失巢凋亡抗性獲得的重要過程之一[17]。

3.1.1 表面標志物的改變

近年來的研究發現，EMT的發生主要體現在各種細胞表面標志物的改變，其中上皮細胞標志物主要有：E-鈣黏蛋白(E-cadherin)，β連環素(β-catenin)和緊密連接蛋白(occludin)等，間質細胞標志物主要有：N-鈣粘蛋白(Ncadherin)，中間絲波形蛋白(Vimentin)和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)等。E-cadherin作為最經典的上皮細胞標志物，在各型EMT中表達均下降[18]。與E-cadherin相反，N-cadherin在EMT中被上調，這種鈣黏蛋白由E-cadherin向N-cadherin的轉變被稱為“鈣黏蛋白開關”，往往被用于監測EMT的 進程[19]。

3.1.2 整聯蛋白介導的細胞粘附

整聯蛋白是一種膜鑲嵌蛋白，是由α和β亞基組成的非共價二聚體。它的胞外結構域能夠識別纖連蛋白和層粘連蛋白，通過與之結合引起構象改變，激活粘著斑激酶(Focal Adhesion Kinase，FAK)等信號分子，啟動下游的信號傳導。胞內結構域能夠結合肌動蛋白，從而實現細胞內外信息的雙向聯絡。整聯蛋白介導的細胞的粘附對于EMT的發生起著決定性的作用，對于失巢凋亡抗性的產生也至關重要。研究發現，敲除ITGB4或者ITGA6之后，會引起失巢凋亡現象的增多[20,21]。除了整聯蛋白之外，FAK的激活或者過表達對于失巢凋亡抗性的產生也起著至關重要的作用[22]。

3.2 自噬與失巢凋亡抗性

自噬是一種溶酶體介導的細胞自我消化的途徑，其作用是為了實現真核細胞中受損、老化、功能異常的細胞器或其他多余細胞質分子的再循環，并且產生營養和能量以維持內環境的穩態，提高細胞的存活率[23]。它通過形成一個雙膜囊泡，即自噬小體，吞噬細胞質成分，并將其傳遞到溶酶體中進行降解。在酵母細胞中，自噬受30多種自噬相關基因(ATG)調控[23]。在之前的研究中發現，Beclin1(ATG6)的缺失會導致小鼠腫瘤發生的增加，ATG5或ATG7的缺失會導致氧化應激的積累，促進腫瘤的發展[24,25]，這些說明自噬的存在對于腫瘤發展有抑制作用。然而，在已建立的腫瘤中，癌細胞需要利用自噬克服環境的壓力(例如：營養缺乏、缺氧和藥物損傷等)，這說明自噬在一定情況下卻具有促進腫瘤生長的功能。由于這種雙重功能，自噬也被稱為癌癥進展中的“雙刃劍”[26]。

3.2.1 自噬與EMT

自噬只是最近才與EMT連接。近年來，一些研究表明，自噬和整聯蛋白信號轉導之間存在一定的關系[27]。細胞ECM附著位點的整聯蛋白受體為粘著斑(focal adhesion，FA)的形成提供了結構基礎，通過張力改變引起粘著斑蛋白磷酸化狀態改變，并改變蛋白構象，促進粘著斑的穩定和生長[28-30]。整合素-ECM粘附的喪失在癌性和非癌性上皮細胞中均誘導自噬，這有利于失巢凋亡抗性產生，使得腫瘤細胞的轉移能力增強[31,32]。

綜上所述，自噬可能通過影響細胞表型的改變或者影響粘著斑的穩定和降解等方面來影響EMT從而導致失巢凋亡抗性的產生。

3.2.2 自噬與氧化應激

在對于乳腺腫瘤模型的研究中發現，自噬與蛋白激酶R樣內質網激酶(PERK) 的活性氧(Reactive oxygen species ，ROS)依賴性活化相關[31]。目前已經證實，PERK可以促進多種癌細胞(包括導管癌乳腺癌細胞、結直腸腺癌細胞和高度轉移性的人纖維肉瘤細胞)產生失巢凋亡癥抗性[33]。在ER中錯誤折疊的蛋白積累之后，未折疊蛋白反應(Unfolded protein response，UPR)的激酶PERK變得活躍，激活eIF2α[34,35]，使得轉錄因子ATF4的上調，從而促進許多細胞存活途徑存活[36]。最近一項研究發現，ATF4缺陷的人纖維肉瘤細胞容易發生失巢凋亡，而當恢復ATF4的表達時，失巢凋亡的發生會被阻斷，細胞更容易存活[33]。

3.3 代謝改變與失巢凋亡抗性

細胞從ECM分離會引發一系列代謝改變，例如葡萄糖攝取不足、細胞ATP含量降低以及線粒體產生的ROS升高等[37]。為了抵抗這些壓力，快速分裂的腫瘤細胞需要快速的ATP生成，并維持適當的氧化還原狀態以支持細胞分裂。腫瘤微環境中氧氣水平和營養水平較低[38]，不利于腫瘤細胞生長，因此，腫瘤細胞通過代謝重編程，以滿足腫瘤生長的需求。Warburg效應是腫瘤細胞中最典型的代謝表型，即相比于正常的細胞，腫瘤細胞會消耗更多的葡萄糖，而且，腫瘤細胞的糖酵解速率遠高于氧化磷酸化速率[39]，這為腫瘤細胞的生長和增殖提供了重要的能量和物質基礎。

ROS是線粒體有氧代謝的固有的產物，正常情況下，ROS能夠維持在一個穩定的水平，當平衡被打破的時候，它則有可能促使細胞發生轉變，從而促進腫瘤的發生發展。在脫離基質后，由于ROS的升高，會激活NF-κB，使得超氧化物歧化酶(Managanese superoxide dismutase，MnSOD)的表達上調，MnSOD是一種ROS清除劑，能夠減少ROS的損傷，與原發性腫瘤相比，MnSOD在轉移灶的表達水平更高。因此，ROS的清除有助于癌細胞產生失巢凋亡抗性[40]。ROS也可以通過激活SRC誘導生存信號產生，活化的SRC可以通過不依賴配體的方式磷酸化EGFR，從而激活MAPK/ERK和PI3K/Akt途徑，最終導致Bim降解和失巢凋亡抑制，這一說法在腸道上皮細胞和轉移性前列腺癌細胞中均得到了證實[41,42]。

3.4 生長因子與失巢凋亡抗性

循環系統中的細胞因子和生長因子等有助于轉移的調節[43]。由于生長因子受體能夠激活細胞存活途徑抑制細胞死亡途徑，因此生長因子受體或其信號傳導途徑的表達失控與腫瘤的惡性程度相關。生長因子受體的異常調節能夠激活生存信號通路，抑制失巢凋亡從而導致轉移。轉化生長因 子-α(Transforming growth factor-α，TGF-α)是EGFR的配體，它能夠逆轉由于附著喪失引起的Src活性和Bcl-xL表達下降來防止腸道上皮細胞的失巢凋亡[44]；轉化生長因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)通常與轉移潛能增加以及患者預后差相關，其主要通過TGF-β1/ Smad信號傳導在EMT過程中起著至關重要的作用[45]。此外，TGF-β1也可以直接激活MAPK途徑，促進細胞的侵襲和轉移；胰島素樣生長因子-1(Insulin-like growth factors-1，IGF-1)被稱為一種“促生長因子”，它對于脫離基質的細胞的保護作用是通過激活PI3K/Akt信號通路實現的[46,47]；血小板衍生生長因子(Platelet derived growth factor，PDGF)也與腫瘤轉移有關，在脫離了ECM的人肺腺癌細胞中，PDGF的受體能夠激活Src，并激活下游的生存信號通路[5]。

4 總結

正常的上皮細胞存活和增殖依賴于與ECM的粘附，當這種粘附被破壞時，容易引發失巢凋亡。失巢凋亡受到不同信號通路的調節，主要通過內源性線粒體途徑和外源性死亡受體途徑激活。EMT的發生對于失巢凋亡抗性產生有著一定的促進作用，自噬對于失巢凋亡的影響是個動態變化的過程，其可以通過影響EMT、氧化應激反應和免疫應答的發生影響失巢凋亡。細胞在脫離基質的粘附之后也會引發一系列的代謝變化，而腫瘤細胞可以通過Warburg效應恢復PPP過程，也可以通過MnSOD的表達減少ROS的損傷或者啟動一系列生存信號途徑以維持細胞的存活。大多數癌癥的死亡是由于轉移的發生而不是原發性腫瘤，而失巢凋亡逃逸是轉移發生的必經之路，因此對于失巢凋亡抗性的機制研究有助于為癌癥的治療方法提供新的思路。