miR15b對K562/a02細胞增殖凋亡及耐藥性的影響

張夢涵，薄海美，劉牧

(華北理工大學，河北 唐山 063000)

0 引言

近20年來，隨著細胞遺傳學和分子生物學技術的應用和發展，一系列與白血病發生、發展及預后相關的基因、受體、細胞內關鍵物質等相繼被發現，使得分子水平的靶向治療以及以這些靶向為目標的新型藥物的研發日益成為研究的熱點。現在我們的醫療行業更加注重循證醫學、精準醫學，而不是過去的經驗主義，只有這樣我們才能更好的把握疾病的病因及其可能發展的走向。DNA/RNA基因、蛋白、生物體，一步步影響著疾病的發展。本綜述內容涉及K562/a02細胞的耐藥機制，為臨床減少治療白血病耐藥性提供靶向幫助及耐藥機制的參考。為臨床白血病的治療帶來希望，減少白血病的耐藥及復燃，減輕病人的經濟、家庭及社會負擔。

1 K562/a02細胞增殖凋亡及耐藥性

1.1 K562/a02細胞與白血病的關系

K562細胞來自慢性髓性白血病患者的淋巴母細胞，也是第一個體外培養的人髓性白血病細胞系，在白血病發病機制研究、藥物靶標和治療等方面具有廣泛的應用和作用，有研究表明TGF-β可誘導K562細胞增殖[1]。而K562/A02是K562的耐藥株。李秀軍研究發現[2]抑制白血病耐藥細胞K562/a02增殖，并通過誘導K562/a02細胞的凋亡可發揮逆轉多藥耐藥作用。

1.2 miRNA與K562/a02細胞關系

近年來，越來越多的研究證據表明，miRNA 基因的突變或miRNA 表達失調與多種人類癌相關，miRNAs能夠發揮促癌或抑癌功能，參與不同類型癌的發生發展[3-4]。有研究發現在過表達miR-150的K562細胞中，c-Myb的mRNA水平沒有明顯改變，蛋白水平則顯著下降，說明miR-150可以特異性抑制K562細胞內c-Myb蛋白水平的表達，可以顯著抑制K562細胞的增殖，對K562細胞周期的運行也具有明顯抑制作用[5]。孫玲研究[6]發現，miR-543可靶向Wnt蛋白，抑制Wnt信號通路活性，從而抑制K562細胞的增殖，增加細胞的凋亡。miR-132是目前比較公認的抑癌性miRNA，轉染miR-132類似物后，K562細胞增殖能力減弱，凋亡增加，其機制可能是通過激活SRIT1/P53凋亡通路，促進相關凋亡蛋白表達，擾亂細胞促凋亡蛋白和抑制凋亡蛋白之間的平衡，從而使細胞凋亡增加[7]。

1.3 ABCC5與K562/a02細胞關系

與白血病耐藥相關的ABCC亞家族成員中，ABCC1與ABCC2結構功能很類似，具有轉運GSH結合物的泵功能，與順鉑和阿霉素耐藥相關；ABCC2和ABCC3/MRP3與甲氨蝶呤耐藥相關；ABCC4/MRP4與6-巰嘌呤和巰鳥嘌呤耐藥有關；ABCC4在ALL中有表達，并且36%的ABCC5/NRP5與ABCC4有同源性，參與了ALL患者的巰嘌呤耐藥性[8]。在伊馬替尼耐藥株細胞系K562-R中證實，ABCA2可以抑制耐受伊馬替尼的化療效果，主要是通過抑制細胞內Wnt和MEK等信號通路來實現[9]。重組腺病毒Ad-siABCG2沉默，ABCG2基因表達可增加K562細胞對ADM和DNR的敏感性，表明 ABCG2基因表達可導致K562細胞產生多藥耐藥[10]。

1.4 K562/a02細胞主要耐藥機制

(1)耐藥細胞過表達跨膜轉運蛋白，導致胞內藥物濃度降低是產生耐藥的主要原因，如P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)是MDR基因編碼的跨膜糖蛋白，屬于ATP結合盒式轉運蛋白，可將化療藥物轉運至膜外。腫瘤細胞膜P糖蛋白過度表達，通過其藥物外排作用將藥物泵出細胞外，胞內藥物濃度下降，導致多藥耐性[11]；(2)凋亡基因的異常，細胞凋亡是在基因調控下的一種細胞自我消亡，是人體組織器官發育中細胞清除的正常途徑，當細胞凋亡受到抑制或阻斷時，細胞沒有正常凋亡，繼續增殖就容易誘發突變。隋晶蕊研究[12]發現寡霉素可通過線粒體途徑誘導K562/A02細胞的凋亡；(3)藥物作用靶點的改變，如產生多種耐藥的靶點蛋白，如BCR/ABL基因P-loop區域、活化P-loop區域及羧基末端區域突變，將導致BCR/ABL激酶結構的改變，破壞其與TKI類藥物的結合，進而使其再激活而產生耐藥作用，也產生多藥耐藥 (MDR)。賈祝霞研究發現[13]耐藥白血病細胞內p-STAT3水平升高，導致細胞表面NKG2D配體的表達降低，從而逃避了免疫細胞的識別和殺傷，這可能是耐藥白血病細胞在體內持續殘留的重要原因之一。也有研究發現耐藥機制可能涉及過度激活的PI3K通路，通過誘導NF-κB核轉錄、激活STAT3通路，進而上調細胞上P糖蛋白的功能與表達，最終介導腫瘤多藥耐藥產生[14]。

2 MiR15b作用機制

2.1 miRNAs功能

微小RNA是一類19～25個核苷酸構成的非編碼小RNA，主要通過結合下游靶基因mRNA的3'UTR區，從而導致靶基因mRNA降解，抑制蛋白的翻譯。MiRNA通過調控基因的表達，參與細胞增殖、分化、凋亡、衰老等多種生物學行為[15-16]。在腫瘤細胞的侵襲轉移、多藥耐藥方面也起到了重要作用[17-18]。MiRNA對造血干/祖細胞自我更新能力的維持、造血細胞的分化、細胞周期的調節等過程，發揮了重要作用。MiRNA可以影響血管內皮細胞增殖、凋亡[19]。在惡性腫瘤的發生發展中也發揮作用[20]。MiRNA中的多數具有和其他參與調控基因表達的分子一樣的特征，在不同組織、不同發育階段中miRNA的水平有顯著差異，這種miRNA表達模式具有分化的位相性和時序性(differential spatial and temporal expression patterns)，提示miRNAs有可能作為參與調控基因表達的分子，因而具有重要意義。MiRNA在人的多個主要組織和多種細胞中均起到重要作用，通過調節miRNA，可以抑制腫瘤細胞的增殖，促進腫瘤細胞的凋亡，影響腫瘤細胞的侵襲、轉移、預后、多藥耐藥，起到更好的治療效果。韋杰合研究[21]發現，miR-218-5p可以與WNT2B結合，miR-218-5p表達的增加抑制骨肉瘤細胞143B中WNT2B的蛋白表達水平，從而抑制骨肉瘤細胞增殖。MiRNA-184在膠質瘤組織中明顯低表達，與膠質瘤的發生發展密切相關，過表達miRNA-184可以減少腫瘤細胞的增殖，增加腫瘤細胞的凋亡[22]。上調miR-145可減少白血病細胞的增殖，并增加細胞凋亡，其機制可能與PI3K/AKT信號通路受到抑制有關[23]。MiRNAlet-7a能顯著抑制HMGA2的mRNA和蛋白表達，進而顯著抑制喉癌細胞的增殖[24]。MiR-449a/b的低表達參與了胃癌的發生、發展過程，并且miR-449a/b能抑制胃癌細胞增殖[25]。MiR-8085在膀胱癌中表達降低，過表達miR-8085可通過干擾TOP2A基因的表達，抑制膀胱癌細胞的增殖能力[26]。MiRNA-196b可能通過靶向抑制IGF2BP1的表達，抑制肝癌HepG2細胞的增殖并促進其凋亡[27]。MiRNA成員中的miRNA-145是一種癌細胞抑制基因，可調控多種目的基因[28]，通過抑制腫瘤細胞分裂、轉移等而控制腫瘤的發展[29]。有研究發現，與正常肺上皮BEAS-2B細胞比較，非小細胞肺癌細胞A549中miRNA-145的相對表達量較低，上調其表達能夠抑制A549細胞增殖，促進細胞凋亡，增強放射敏感性[30]。MiRNA-145低表達也可能與卵巢癌的發生發展有關，過表達miRNA-145能夠抑制卵巢癌細胞株的增殖、遷移和侵襲，miRNA-145可以作為治療卵巢癌的新靶點[31]。有分析表明，miR-345-5p在前列腺癌患者血清中的表達較高，能夠對前列腺癌細胞產生影響，高表達miR-345-5p與前列腺癌患者預后不良相關，miR-345-5p可以促進前列腺癌細胞增殖與侵襲[32]。MiR-373表達下調可顯著抑制皮膚鱗癌細胞的增殖，促進細胞凋亡，其凋亡誘導作用可能與caspase-3活性升高有關[33]。MiRNA-223-3p在胃癌組織中高表達，下調miRNA-223-3p表達能抑制細胞增殖和遷移，促進細胞凋亡，其作用機制與JAK2/ STAT3信號通路的調節有關[34]。將miR-106a-5p mimics或siPTEN轉染至K562細胞，隨后用Pae處理，研究發現過表達miR-106a-5p或抑制PTEN表達可逆轉Pea對白血病細胞增殖、凋亡的影響，Pea通過下調miR-106a-5p/PTEN信號通路蛋白抑制白血病細胞增殖，促進其凋亡[35]。特定miRNA的異常表達會影響細胞相關蛋白的表達、抗腫瘤藥物與靶點的結合以及凋亡相關途徑從而引起耐藥，miRNA介導的基因表達的下調與腫瘤的發生、轉移和腫瘤對治療的反應有關，miRNA的異常導致了乳腺癌耐藥的發生[36]。多種miRNA在乳腺癌中表達異常，與放療抵抗和多重耐藥有關[37]。有研究結果顯示，miR-135a-5p在胰腺癌細胞中低表達，上調胰腺癌細胞中miR-135a-5p的表達水平，可以抑制腫瘤細胞增殖、遷移，提高順鉑敏感性，說明miR-135a-5p在胰腺癌中具有重要的作用[38]。上調miRNA-506能逆轉A549/DDP細胞對順鉑的耐藥，這一過程可能通過miRNA-506調控多藥耐藥蛋白和凋亡相關蛋白實現[39]。

2.2 miR-15b的位置

在ATRA治療 APL的過程中，miR-15b的表達量急劇增加。miR15b定位于3號染色體，在人的各個主要組織和多種細胞中均有表達，其中包括免疫系統的T淋巴細胞、B淋巴細胞、單核細胞，循環系統的網狀紅細胞、血小板、粒細胞。有研究表明沉默惡性黑色素腫瘤中的miR-15b表達后，細胞遷移距離、細胞轉移和侵襲能力均受到顯著抑制[40]。

2.3 miR-15b的功能

靶基因集合功能富集于蛋白激酶活性、GTP結合蛋白調控等分子功能，蛋白氨基酸磷酸化、細胞周期調控等生物學過程，提示miR-15b可能在這些生物學過程中發揮了重要功能。孫文陽研究[41]發現miR-15b在細胞增殖、凋亡等過程中發揮重要作用。黃寶和研究[42]發現隨著神經功能缺損評分增加，患者血清中miR-15b表達量升高，而VEGF、Ang-2濃度降低，說明miR-15b表達可能與神經功能缺損嚴重程度有關。

3 靶基因mRNA降解對ABCC5的影響

3.1 ABCC5功能

ABCC5是ABCC (ATP-bindingcassette transporter family class C，ABCC) 蛋白轉運體家族的成員，介導眾多內源性代謝產物和外源性藥物從細胞內向外轉運。張鵬研究發現[43]ABCC5與培美曲塞對乳腺癌化療耐藥有顯著相關性。轉染ABCC4或者ABCC5可以減少腫瘤細胞內的藥物濃度，增強腫瘤細胞對藥物的耐受性。李汝平研究[44]發現ABCC5/MRP5基因在NK/T細胞淋巴瘤中的高表達，有可能提高了化療的耐藥性，降低化療療效，嚴重影響了預后。在臨床研究中發現，長期使用順鉑治療的患者，肺癌組織中ABCC5的mRNA水平明顯增高[45]。經過化療治療的多形性膠質母細胞瘤患者，ABCC5表達水平較高的患者預后較差[46]。對5-Fu耐藥的胰腺癌細胞中，只有針對ABCC5的RNAi可以逆轉胰腺癌細胞對5-Fu耐藥[47]。

3.2 miR-15b靶向ABCC5的機制

近年來發現miR-15b可以與CCNE1的3'UTR端結合，抑制下游靶基因CCNE1的表達[48]，并且與調控細胞周期的關鍵蛋白有關[49]。也有研究發現miR-15b能夠與CDK4 mRNA 3'UTR結合，CDK4的蛋白表達水平降低[50]。推測miR-15b是通過結合下游靶基因mRNA的3'UTR區從而導致靶基因mRNA降解，抑制蛋白(ABCC5)的翻譯，從而減少耐藥。因為ABCC5是介導眾多內源性代謝產物和外源性藥物從細胞內向外轉運，從而減少細胞內化療藥物濃度，可導致多藥耐藥。

4 展望

微小RNA家族展現出抑制癌細胞增殖，促進癌細胞凋亡和治療耐藥的特性，決定了可能在治療惡性腫瘤中起到重要作用。