恒溫擴增芯片法在下呼吸道感染常見病原體檢測中的臨床應用

李素娟 汪環 徐麗娟 牛臘梅

【摘要】目的：研究在下呼吸道感染中恒溫擴增芯片法對痰液樣本中病原體檢測的臨床應用價值。方法：選取本院2019年11月至2020年1月間收集的143例下呼吸道感染患者，采用恒溫擴增芯片法檢測患者的痰液樣本，同時以傳統病原學檢測方法（培養法）與之進行比較，判斷其在臨床應用中的價值。結果：采用恒溫擴增芯片法和培養法共檢測了143例下呼吸道痰液樣本，其中，總體恒溫擴增芯片法的陽性檢出率61.54，高于病原分離培養的檢出率25.87%。兩種方法的檢測結果一致性為64.34%，其中，肺炎克雷伯菌（Kappa=0.848）和金黃色葡萄球菌（Kappa=0.632）的檢出情況在兩種方法下的一致性較高。結論：相較于傳統培養法，恒溫擴增芯片法可以快速地檢測常見病原體，檢測時間短，且檢測結果更加靈敏，陽性率更高，可以輔助臨床快速、準確判斷下呼吸道感染的致病原，有針對性地用藥和治療。

【關鍵詞】恒溫擴增芯片法;LAMP;培養法

[中圖分類號]R446.5：R56 [文獻標識碼]A [文章編號]2096-5249（2021）01-0142-03

下呼吸道感染（lower respiratory tract infections，LRTIs）是一種臨床上的常見病、多發病[1]，嚴重威脅著人類的健康，由于大氣污染、人口老齡化、吸煙等多種因素，數據顯示成人死亡中下呼吸道感染者約占3%～5%[2]，居高不下的發病率和死亡率居給社會造成了巨大的經濟負擔。下呼吸道感染疾病可感染的病原體類型多樣，包括細菌、病毒、非典型病原體等。復雜的疾病類型加上多樣的病原體，導致臨床上普遍存在著對LRTIs確診難、用藥難的情況，因此，在治療LRTIs方面，及早明確病原體是極為關鍵的[3]。本研究采用恒溫擴增芯片法與傳統病原菌培養法，對143例LRTIs疑似患者進行了病原檢測，初步了解新型的恒溫擴增芯片法在臨床上的應用價值。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象 選取2019年11月至12月在蘭州市第一人民醫院就診的143例LRTIs患者，其中男80例（55.9%，80/143）、女63例（44.1%，63/143），采集深部痰液樣本作為研究對象，年齡2～93歲，臨床診斷主要為發熱、咳嗽咳痰或咳血、社區獲得性肺炎、支氣管肺炎、急性支氣管炎、慢性肺心病等常見下呼吸道感染疾病。

1.2 儀器和試劑 試劑來源于北京博奧生物研發的呼吸道病原菌核酸檢測試劑盒（恒溫擴增芯片法），該試劑盒檢測結果由博奧生物集團有限公司研發的RTisochipTM-A恒溫擴增芯片核酸分析儀進行分析。低速離心機（用于離心恒溫擴增芯片）、200μL離心管、微量移液器（規格：10～100μL）以及各種規格的離心架都是本實驗室配置。

1.3 方法 ①恒溫擴增芯片法：按照試劑盒的要求采集所有患者痰液標本，同時處理樣本并提取核酸，運用微流控芯片、恒溫擴增技術，利用具有鏈置換功能的聚合酶在65℃恒溫條件下進行反應，應用熒光染料摻人法進行實時熒光檢測，擴增陽性的樣品會產生類似實時熒光恒溫的“S”形擴增曲線，一步完成對靶基因的擴增和檢測。應用核酸分析儀展開分析，一步完成檢測13種常見下呼吸道病原菌，包括流感嗜血桿菌、嗜肺軍團菌、肺炎支原體、肺炎衣原體、結核分枝桿菌復合群等[4]。

1.4 統計學分析 數據使用SPSS21.0統計學軟件分析和處理，用x2檢驗、例（%）表示計數指標，當P<0.05，說明差異顯著。采用Kappa分析一致性，在Kappa>0.4的情況下表示檢驗結果具有一致性。

2 結果

2.1 分析恒溫擴增芯片法 檢出下呼吸道感染常見病原體的情況在143例痰液標本中，共檢出88例呼吸道病原體陽性標本，整體陽性率為61.54%（88/143）。單種病原體感染樣本49例（55.68%，49/88），混合感染樣本39例（44.32%，39/88），其中以肺炎支原體、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌及流感嗜血桿菌混合感染占多數。88例陽性標本中檢出12種共134株呼吸道病原體，其中檢出率占比前三位的分別為流感嗜血桿菌占32.84%（44/134），肺炎鏈球菌占26.12%（35/134），肺炎支原體占14.18%（19/134）。本次樣本中未檢出嗜肺軍團菌，詳見表1。

2.2 細菌培養法 對下呼吸道感染常見病原體的檢出情況143例的痰液標本中，采用傳統培養法進行培養，其中37例標本培養出病原體，整體陽性率25.87%（37/143），其中單種病原感染樣本32例（86.49%，32/37），混合感染樣本僅5例（13.51%，5/37），包括4例肺炎鏈球菌和其他病原體的混合感染，以及1例鮑曼不動桿菌和嗜麥芽窄食單胞菌的混合感染。同時，37例陽性標本中共檢出9種40株常見的病原體，其中檢出率占比前三位的分別為流感嗜血桿菌占25.00%（10/40）、肺炎鏈球菌占30.00%（12/40）、金黃色葡萄球菌占17.50%（7/40），詳見表2。

2.3 恒溫擴增芯片法與培養法 對下呼吸道常見病原體檢出情況的結果比較對共計143例樣本同時進行了恒溫擴增芯片法與培養法的檢測，結果顯示：恒溫擴增芯片法檢測出病原體陽性的樣本共88例，總陽性率為61.54%（88/143），遠高于培養法的檢測陽性率25.87%（37/143）。其中，芯片法與痰培養兩組結果均陽性37例，陰性55例，50例芯片法檢測陽性、痰培養結果陰性，1例芯片法檢測陰性、痰培養陽性。兩種檢測結果的一致性為64.34%（92/143），陽性符合率為25.87%（37/143），陰性符合率為38.46%（55/143），差異有統計學意義（x2=23.657，P=0.000），詳見表3。

而對于不同種病原菌的檢出情況比較，肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌在兩種檢測方法中的一致性都較高;其中，檢出一致性較好的前三位分別為肺炎克雷伯（Kappa值為0.848）、金黃色葡萄球菌（Kappa值為0.623），耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Kappa值為0.579）;嗜麥芽窄食單胞菌在兩種方法中都是在混合感染中被檢出，并且不具備一致性。

3 討論

本項研究采用的主要方法是恒溫擴增芯片法，該檢測方法是將微流控生物芯片技術和環介導等溫擴增技術相結合。因該檢測技術不需要模板的變性、退火的溫度變化過程，1h內可完成檢測，可大大縮短檢測周期[6]。

本研究結果表明恒溫擴增芯片法檢測病原體陽性的樣本共88例，其中混合感染占39例，總陽性率為61.54%（88/143），遠高于培養法的檢測陽性率25.87%（37/143）。本研究結果也與之前的研究報道門類似，而從方法學本身的比較中可推論，恒溫擴增芯片法較傳統培養法病原體檢出率高的原因可能在于：（1）傳統病原體培養對于樣本來源、樣本條件、操作要求等多方面要求較高，導致陽性率不高;（2）恒溫擴增芯片法能夠從極微量的病原體遺傳物質中進行拷貝和擴增，檢測靈敏度較高;（3）有些病原體，比如流感嗜血桿菌，服藥后，培養陽性率會降低?？梢钥闯觯瑑煞N方法的陽性和陰性符合率都比較低，一致性也不高，這可能與傳統痰液培養法病原體檢出率較低及部分病原菌無法培養、培養周期較長等因素相關[s]o

對本院的下呼吸道病原體分布情況進行統計得出，本研究中的88例陽性標本中檢出12種共134株呼吸道病原體，其中檢出率占比前三位的分別為流感嗜血桿菌占32.84%（44/134），肺炎鏈球菌占26.12%（35/134），肺炎支原體占14.18%（19/134）與文獻報道基本吻合。此次研究的樣本絕大多數是來自兒科的樣本，共檢出19例肺炎支原體和3例肺炎衣原體，肺炎支原體的檢出率為14.18%，排在第三位，與文獻報道情況吻合。對于支原體、衣原體等非典型病原體，是無法通過培養法進行檢測的，說明恒溫擴增芯片法在非典型病原體感染的診斷中有更好的應用價值。

綜上所述，相較于傳統培養法，恒溫擴增芯片法可以快速地檢測常見病原體，檢測時間短，且檢測結果更加靈敏，陽性率更高，可以輔助臨床快速、準確判斷下呼吸道感染的致病原，有針對性地用藥和治療。

參考文獻

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[8]王詠紅，郭雅潔，陳玉瑩，等.恒溫擴增芯片法在兒童下呼吸道感染性疾病中的應用價值評估[J].中國循證兒科雜志，2018，13（3）：176-179.