潛伏結核感染相關蛋白抗原的研究進展

沈瑤，陳玲

目前全球結核病形勢日益嚴峻。結核病是由單一致病菌——結核分枝桿菌（Mtb）感染所致死亡人數最多的一種傳染性疾病，也是全球十大疾病死因之一。潛伏結核感染（LTBI）通常是指體內存在Mtb，但無活動性結核病（ATB）表現如結核病癥狀、組織器官損傷及病原學依據等，而機體對Mtb刺激產生持續性免疫應答的一種狀態［1］。據WHO統計，全球約有25%的人口感染Mtb，其中多數患者處于LTBI狀態，如不進行相關治療，則有5%～10%會進展為ATB［2］，若宿主免疫力降低，則這一風險更高，如HIV陽性的LTBI者發展為ATB的可能性是HIV陰性LTBI者的30倍［3］。對LTBI高風險人群進行準確診斷和早期干預能有效降低LTBI發生率，減少傳染源［2］。由于LTBI者體內的Mtb處于半休眠或休眠狀態，且這種狀態下的Mtb基本不繁殖、數量也較少，因此臨床主要根據機體對Mtb抗原的免疫反應進行診斷［4］。目前，臨床主要采用結核菌素試驗（TST）、體外γ-干擾素釋放試驗（IGRA）檢測宿主免疫反應，但其并非是LTBI的特異性診斷方法，無法區分ATB與LTBI［5］。因此尋找LTBI相關蛋白抗原成為目前國內外研究的熱點。但目前關于LTBI診斷性抗原的研究結果差異較大，可能與研究人群、環境、遺傳等因素有關。且目前針對嬰幼兒、HIV陽性、使用免疫抑制劑等免疫狀態異常人群LTBI的檢測研究較少。Mtb可在機體免疫系統功能下降時由半休眠或休眠狀態重新復蘇并再次繁殖，進而進展成為ATB［6］，因此，對于上述特殊人群LTBI的檢測尤為重要。本文針對具有潛在診斷價值的LTBI相關蛋白抗原的研究進展做一綜述，以為LTBI的診斷提供參考。

1 LTBI的發生發展

Mtb屬于胞內寄生菌，侵入人體后可被巨噬細胞吞噬，引起固有免疫反應，活化的巨噬細胞雖可在一定條件下清除Mtb［7］，但僅依賴固有免疫反應無法徹底清除Mtb，而被感染的巨噬細胞可釋放大量抗原，其經樹突細胞加工后呈遞給特異性T淋巴細胞，進而引發獲得性免疫應答反應，其中巨噬細胞被T淋巴細胞產生的細胞因子激活，進而發揮殺傷或清除Mtb的作用［8］；另外，Mtb可通過一系列免疫逃逸機制在巨噬細胞內長期存活［9］。肉芽腫形成被認為是宿主針對早期LTBI免疫反應的主要特征，肉芽腫組織存在缺氧、饑餓、低pH值的微環境，可為機體對峙病原體創造一個相對封閉的環境，并誘導Mtb進入半休眠或休眠狀態［10］，使Mtb處于低代謝狀態，基本不繁殖，進而逃避或抵抗宿主免疫攻擊，最終形成LTBI狀態［11］。但當宿主免疫力下降時，休眠的Mtb可復蘇、繁殖、播散，最終導致ATB［12-15］。綜上，人體感染Mtb后有3種情況：一是宿主免疫系統徹底清除Mtb；二是Mtb快速增殖，發展為ATB；三是宿主免疫系統對Mtb的清除作用與Mtb的抗清除作用處于動態平衡，形成LTBI狀態，當宿主免疫力降低或細菌毒力增加時則導致ATB［16］。

2 LTBI的診斷方法

目前針對LTBI的診斷缺乏統一的標準，臨床主要通過免疫學檢測間接診斷［4］，包括基于細胞免疫的TST和IGRA，及基于體液免疫的血清學檢測，其中TST使用的是多種分枝桿菌粗制抗原的混合物，包含牛分枝桿菌（BCG）、Mtb及非Mtb（NTM）的抗原，因此該方法對BCG疫苗接種和NTM感染存在交叉反應，鑒于我國普遍進行BCG疫苗接種、存在一定比例的NTM感染，導致TST檢測Mtb的特異度并不高。而IGRA使用的是Mtb特有而BCG缺失的差異區域（RD）上由Rv3874基因編碼的培養濾液蛋白10（CFP-10）和Rv3875基因編碼的早期分泌靶向抗原6（ESAT-6），與TST相比，IGRA能夠排除BCG疫苗感染，對檢測Mtb的特異度較高［17-18］，但因該方法無法區分ATB與LTBI，極大限制了其診斷LTBI的臨床指導意義和應用價值［5］。除了細胞免疫學方法，基于檢測抗體的血清學檢測也是有望成為檢測LTBI的重要方法，其具有特異度高、耗時短和易于批量檢測的優勢，特別適用于高結核病負擔和資源有限的國家［5］。但目前血清學檢測診斷LTBI的效果并不理想，不同的研究結果差異較大［19-21］，可能與使用抗原的特異性和免疫原性有關。由于目前針對LTBI的診斷方法存在上述問題與不足，因此尋找具有更高診斷價值的生物標志物仍是LTBI診斷困境的突破點。

3 LTBI相關蛋白抗原

研究發現，結核病不同感染狀態均具有特異性的抗原特征譜，通過免疫分析可以區分不同感染狀態［22-23］。一些模擬LTBI環境的低氧或饑餓模型研究發現，Mtb可通過調節基因轉錄或蛋白表達而適應不同的外界環境，使用體外LTBI模型與全基因組、轉錄組分析相結合，鑒定出在LTBI期間表達上調的基因，稱為LTBI相關蛋白抗原，其編碼蛋白為潛伏期相關蛋白抗原［24-26］，主要包括休眠相關蛋白抗原、復蘇促進因子（Rpf）、饑餓刺激因子和毒素-抗毒素系統（TAS）。

3.1 休眠相關蛋白抗原 細菌由復制狀態進入持續性非復制狀態稱為“休眠”，Mtb處于休眠狀態時會產生潛伏感染相關基因的特異性表達，主要包括休眠調節單元（DosR）、持久性缺氧反應（EHR）基因組、LuxR轉錄子家族和Lsr2相關基因四大類基因，這些基因的表達產物稱為休眠相關蛋白抗原。ALBRETHSEN等［26］通過構建低氧、高一氧化氮模型模擬肉芽腫微環境，利用基因芯片技術發現了48個在休眠狀態下表達明顯上調的基因，命名為DosR，而Mtb應對肉芽腫微環境壓力的第一反應是由DosR完成，DosR是Mtb由復制狀態過渡到休眠狀態的關鍵調控子，可增加Mtb的適應性［27-29］。但缺氧期間DosR基因的表達是短暫的，大多數DosR基因在表達上調24 h后恢復到基線水平。調控DosR基因后，Mtb通過EHR調控相關調節因子和酶促反應使其能夠長期處于休眠狀態，這種EHR約由230個基因參與，其表達獨立于DosR基因介導的初始缺氧反應［25］。LuxR轉錄子家族基因是一類在革蘭陰性菌群體感應LuxR/LuxI環路中起重要調控作用的蛋白。FANG等［30］在體外低氧模型中發現，敲除LuxR轉錄子家族成員Rv0195可降低細胞存活率和Mtb從休眠狀態中快速恢復的能力，證實了Rv0195與細菌致病性相關，具有休眠調節功能。Lsr2相關基因是一類組蛋白樣DNA結合蛋白，具有抑制基因表達的作用［31-32］，還可參與Mtb休眠狀態的建立。BARTEK等［33］證明了Lsr2相關基因是Mtb適應氧含量變化所必需的轉錄調節因子，其可使Mtb不斷地適應微環境中的氧含量變化，特別是維持Mtb在低含氧量的肉芽腫中長期存活，是造成宿主持續感染的重要因素。研究表明，休眠相關蛋白抗原具有診斷LTBI的潛在價值，目前應用前景較高的主要有HspX（Rv2031c）、Rv1733c、NarK2（Rv1737c）、PfkB（Rv2029c）、Hrp1（Rv2626c）、Rv2628、NrdZ（Rv0570）、Rv1813c、Rv1996、Rv2004c、Rv2028c 和 DevR（Rv3133c）［28，34-40］。休眠相關蛋白抗原具有較高免疫原性，且數量較多，未來可用于LTBI的診斷及ATB新型疫苗的研究。

3.2 Rpf 休眠菌復蘇是LTBI進展為ATB的關鍵環節，Rpf在其中起到了重要作用［36，39］。1998年 MUKAMOLOVA 等［41］首次從藤黃微球菌的培養液中分離出1個大小約16 KD的蛋白質，其可促進高G+C含量的革蘭陽性菌（如藤黃微球菌、BCG和Mtb）的復蘇和生長，被命名為Rpf。Mtb可編碼5種具有與Rpf相似特征和特性的蛋白，如RpfA（Rv0867c）、RpfB（Rv1009）、RpfC（Rv1884c）、RpfD（Rv2389c） 和RpfE（Rv2450c）。Rpf含有溶菌酶結構域，有利于休眠菌細胞壁的溶解、重構，釋放胞內小分子物質來參與細菌復蘇，對包括Mtb在內的休眠放線菌復蘇具有關鍵作用［42-43］。體外研究表明，在Mtb基因組中敲除單個Rpf基因，并不能完全抑制休眠菌復蘇［44］，這可能是因為Mtb Rpf基因的表達動力學以不同程度重疊的獨特形式出現。另有研究表明，RpfA與RpfD在LTBI人群中表現出了良好的免疫原性，且可特異性誘導CD4+、CD8+T淋巴細胞增殖，提高細胞因子表達能力［36，45］。SERRA-VIDAL等［46］研究也發現，RpfD刺激潛伏感染組產生的γ-干擾素（IFN-γ）水平高于ATB組，提示RpfD抗原有助于鑒別LTBI與ATB。可見Rpf在LTBI進展為ATB的過程中發揮了重要的調節作用，故其具有潛在的基礎研究與臨床應用價值。

3.3 饑餓刺激因子 饑餓刺激因子是由細菌適應饑餓條件而表達上調的一組編碼基因。 BETTS等［47］通過基因組微陣列和蛋白組學分析，觀察休眠狀態的Mtb在饑餓狀態下基因及蛋白質表達情況，篩選出與LTBI相關的特異性蛋白抗原，并將其命名為饑餓刺激因子。饑餓刺激因子對抑制細菌在休眠狀態的轉錄過程、能量代謝、脂質合成和細胞分裂有一定作用。饑餓刺激因子是與LTBI相關的特異性蛋白抗原，其中Rv2653c、Rv2654c、Rv2659c和Rv2660c均表現出較好抗原性，且更易被LTBI人群識別，具有潛在的診斷價值［48-50］。李邦印等［49］研究發現，Rv2659c和Rv2660c在LTBI中較ATB能使宿主產生更高水平的細胞因子，并且使分泌IFN-γ/腫瘤壞死因子α（TNF-α）/白介素（IL）-2的多功能CD4+T淋巴細胞分數增加。綜上，饑餓刺激因子有較好的抗原性，可用于LTBI診斷標志物的研究及臨床應用。

3.4 TAS TAS通常由2個基因的操縱子組成，其中一個具有毒性效應，可促使細胞進入休眠狀態，另一個則是抗毒素，可抵消毒性效應以允許細胞生長［51］。TAS可以抑制細菌在生長表型和非生長表型（休眠狀態）之間的轉換。Mtb在應激條件下能夠降解抗毒素，釋放毒素干擾或改變細菌DNA復制、三磷酸腺苷（ATP）和細胞壁合成，促進細菌快速適應環境變化，進而發揮毒素-抗毒素活性，使其進入休眠狀態［52-53］。生物信息學分析顯示，Mtb基因組中TAS至少有88個，包括同源的62個基因對（47個VapC家族、9個MazEF家族、3個relE家族、2個ParD家族和1個HigB家族）以及另外26個新型TAS，其中已發現VapC-MT（Rv0596c-Rv0595c）、VapBC-MT3（Rv0301-Rv0300）、MazF-MT6與RNA結合后可啟動毒性，從而抑制蛋白質合成，導致細菌生長停滯，進入LTBI［54-56］，因此，推測TAS對LTBI具有潛在的診斷價值，但目前關于TAS免疫原性的報道較少，有待進一步研究。

4 單個蛋白抗原在LTBI檢測中的應用

4.1 PfkB 6-磷酸果糖激酶PfkB屬于DosR家族成員之一，對維持休眠狀態Mtb的長期生存有重要作用［57］。有研究表明，PfkB能誘導較強的T淋巴細胞介導免疫反應［58］。近年多項研究已證實，不同人群的LTBI對PfkB的免疫反應均強于ATB，提示了 PfkB 在免疫學診斷 LTBI中的重要性［28，34-35，59-61］。ARROYO 等［36］比 較 DosR（NarK2，PfkB 和 Rv2628）、RpfA、RpfD、重組融合蛋白ESAT-6-CFP10（E6-C10）和結核菌素（PPD）抗原刺激潛伏感染組和ATB組的外周血單核淋巴細胞，檢測細胞上清液IFN-γ水平，發現PfkB是區分潛伏感染組和ATB組的最優單一抗原，其特異度和靈敏度分別為76.2%、90.0%，診斷潛伏感染和ATB的準確率分別為78.3%、88.9%。一項針對中國人群的研究顯示，PfkB抗原鑒別潛伏感染和ATB的靈敏度和特異度分別為84.3%、80.0%［35］，推測PfkB抗原有望成為鑒別LTBI和ATB的診斷標志物。

4.2 Rv2028c Rv2028c屬于休眠調節單元，編碼一種假想蛋白，而假想蛋白是一類目前功能未知但又真實存在的蛋白。趙慧敏等［62］招募了三組不同Mtb感染狀態的人群：LTBI組、ATB組和健康人群組，用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測Rv2028c和6-kDa早期分泌抗原靶標（ESAT-6）特異性IFN-γ水平，結果顯示，LTBI組中Rv2028c特異性IFN-γ水平最高，ROC曲線下面積高達0.938 8，因此推測Rv2028c具有作為LTBI免疫學診斷候選抗原的潛力。

4.3 HspX α-晶狀體蛋白HspX屬于DosR蛋白之一，對維持Mtb在宿主體內的持續感染具有重要作用［63］。BAUMANN等［64］研究發現，HspX具有較強的B細胞免疫原性，這種免疫反應在ATB患者中較弱，而在疑似LTBI人群中檢測到HspX抗體滴度卻很高［65-66］。ZHANG等［67］認為，Mtb的分泌蛋白Ag85B、HspX和ESAT6可作為鑒別ATB和LTBI的優勢初步篩選抗原，并用ELISA檢測了針對這3種分泌蛋白的免疫球蛋白（Ig）G血清抗體，結果表明診斷LTBI的最佳抗原組合是HspX/ESAT6，其特異度和靈敏度分別為75.0%、76.7%。CASTRO-GARZA等［68］研究表明，與ATB患者相比，LTBI患者具有更高的抗HspX IgM水平（P=0.003）；并且參考RABAHI等［69］的分類標準將受試人群分為健康組、ATB組、既往LTBI組以及新近LTBI組（1年內PPD試驗轉陽性），研究發現，新近LTBI組與其他組間HspX特異性IgG和IgM水平有明顯差異，基于OD492值的ROC曲線分析結果顯示其靈敏度和特異度均為100.0%，其中用于識別新近LTBI患者的IgG截斷值為1.7，IgM截斷值為1.2。以上結果支持了將HspX作為診斷LTBI的血清標志物這一觀點。

4.4 Rv2004c Rv2004c是休眠狀態的Mtb適應缺氧環境相關的蛋白之一，具有T淋巴細胞和B淋巴細胞表位，有望成為結核病診斷和疫苗研發的候選物［70］。在結核病高負擔國家印度，DODDAM等［71］研究發現，LTBI組的Rv2004c特異性IgG抗體滴度明顯高于健康對照組和ATB組（P＜0.000 1），健康人群組、LTBI組和ATB組的中位數抗體滴度分別為0.3、0.9和0.6，推測與ATB和健康人群相比，Rv2004c在LTBI中可引起更為強烈的體液免疫反應，提示Rv2004c可作為血清標志物診斷LTBI。

5 聯合蛋白抗原在LTBI診斷中的應用

不同人群以及不同個體間存在遺傳背景和免疫水平的差異，另外Mtb蛋白抗原在LTBI的不同階段表達量、宿主和病原等因素使得采用任何單一蛋白抗原作為LTBI的診斷標志物均會產生30%～40%的假陽性率［72］，因此，為了增加診斷LTBI的特異度，減少不同人群或個人免疫差異的影響，采用多個蛋白抗原聯合診斷LTBI以彌補單個蛋白抗原診斷LTBI的不足，是更有應用前景的方案。

5.1 PfkB、HspX、Acg、Rv2627c、DevR和Rv3716c 6種蛋白抗原組合 有研究表明，Mtb蛋白抗原與LTBI和ATB均相關，因此基于Mtb蛋白抗原的免疫色譜方法診斷LTBI的靈敏度欠佳［73］。有研究者進一步從DosR家族中選擇PfkB、HspX、Acg（Rv2032）、Rv2627c、DevR（Rv3133c） 和 Rv3716c用作診斷蛋白抗原，將受試者分為LTBI組、ATB組、健康人群組和非ATB組，檢測其血清中特異性抗體，結果顯示，該聯合蛋白抗原診斷LTBI患者的靈敏度為75.0%，特異度為88.1%，其陽性預測值與陰性預測值分別為77.4%和86.7%［74］，提示這6種蛋白抗原組合可提高現有LTBI試紙的診斷效能。

5.2 Apa、HspX、PE_PGRS26、Rv0494、PhoY1、GrpE、SecA2和PPE3 8種蛋白抗原組合 賀仁忠等［75］利用商品化的MtbprotTM結核分枝桿菌蛋白芯片（廣州博翀生物科技有限公司生產）與健康人群組、LTBI組和ATB組臨床血清標本雜交，篩選組間IgG/IgM抗體差異響應蛋白，用差異較大的100個Mtb蛋白定制蛋白芯片，通過大樣本臨床血清標本檢測進一步篩選出LTBI新型診斷候選標志物8個，包括Apa（Rv1860）、HspX（Rv2031c）、PE_PGRS26（Rv1441c）、Rv0494、PhoY1（Rv3301c）、GrpE（Rv0351）、SecA2（Rv1821）和PPE3（Rv0280），采用204份臨床血清標本進行臨床驗證，結果顯示，該組合診斷LTBI的靈敏度及特異度分別為83.10%和90.90%，ROC曲線下面積為0.941，顯示其具體較高的LTBI診斷價值。由于LTBI人群個體差異較大，多個抗原的組合可提高LTBI診斷的靈敏度及特異度。

5.3 Rv0569、Rv1996、Rv2030、HspX、Hrp1、Rv2628、Rv3129、Rv3131和DevR 9種蛋白抗原組合 SHI等［76］將Mtb休眠狀態下表達量最高的25個DosR蛋白抗原［77］定制成膜陣列，檢測健康對照組、LTBI組以及ATB組的抗體水平，通過線性判別分析鑒定出一組包含9種DosR蛋白抗原的最優組合，這9種蛋白抗原分別為Rv0569、Rv1996、Rv2030、HspX（Rv2031c）、Hrp1（Rv2626c）、Rv2628、Rv3129、Rv3131和DevR（Rv3133c），進一步用獨立臨床血清樣本（健康對照組14例、ATB組10例、LTBI組10例）評估上述9種蛋白抗原組合預測ATB和LTBI的準確性，測試結果顯示，其預測ATB和LTBI的靈敏度分別為100%（10/10）和90%（9/10），特異度均為100%（14/14），整體檢測正確率為97.1%，證實該蛋白抗原組合對于區分Mtb感染的不同狀態有較高的靈敏度和特異度。

6 小結

全球結核病形勢日益嚴峻，LTBI者是結核病的主要人群，因此早期診斷LTBI并對高危人群進行預防性治療對結核病的防控具有重要意義。LTBI相關蛋白抗原主要包括休眠相關蛋白抗原、Rpf、饑餓刺激因子、TAS等，這些LTBI相關蛋白抗原在未來結核病新型疫苗與LTBI診斷試劑的研發中具有較好的應用前景。

作者貢獻：沈瑤進行文章的構思與設計、文獻/資料的收集與整理，撰寫論文；陳玲進行文章的可行性分析，進行論文及英文的修訂，負責文章的質量控制及審校，并對文章整體負責、監督管理。

本文無利益沖突。