牛結節性皮膚病的實驗室診斷與防治

桂芳/內蒙古錫林郭勒盟烏拉蓋管理區動物疫病預防控制中心 026321

1 病原

病原是結節性皮膚病病毒（LSDV），屬DNA 病毒羊痘的痘病毒家族包括羊痘病毒（SPV），山羊痘病毒（GPV）和LSDV，具有97%的核苷酸同一性，并且在血清學上具有交叉保護作用。盡管Capripox 的其他菌株感染綿羊和山羊，但LSDV 與牛有關。LSDV 以兩種傳染形式存在：具有單個外膜的成熟病毒體（MVS）和專門用于細胞間擴散的包膜病毒體（EV）具有附加膜。

2 簡介

宿主對LSDV 感染的易感性受許多因素影響。CaPV 感染的免疫主要是細胞介導的，因為大多數子代病毒仍保留在被感染的細胞內。通過在本地直接在細胞之間傳播，該病毒不在循環抗體的范圍內。通過從受感染細胞中萌芽釋放的細胞外包膜病毒體，可能感染鄰近細胞或逃逸到血液中，并在全身傳播。LSDV 的傳播是通過蚊子，蒼蠅和蜱。

已知對牛的LSDV 感染具有天然抵抗力，并且亞臨床LSDV感染很常見。LSDV 造成重大的經濟損失，主要是由于導致牛奶產量嚴重下降，體重減輕，流產，不育和生皮損害。為了成功地控制LSD，所有易感動物的疫苗接種被認為是主要支柱，并輔之以其他控制措施，例如撲滅，動物移動限制和媒介控制。

3 臨床特征

該疾病的特征是發燒、皮膚黏膜和內臟器官上的結節性病變。可能會出現牛奶產量減少，生皮受損，暫時或永久不育和受感染動物死亡的情況，從而在受影響的國家造成重大的經濟后果。臨床體征的嚴重程度取決于病毒的株系和被感染牛的品種。傳播主要是通過叮咬昆蟲的間接接觸。LSDV 的平均潛伏期為6 ～9d。該疾病的平均死亡率約為10%。

4 材料與方法

4.1 動物和組織采樣從受影響的動物中收集生物標本。在實驗室進行檢測。從患病動物的脖子和頭部收集結節性皮膚病變的皮膚刮擦5mL 血樣。尸檢是對表現出與LSD 一致的病死牛進行的。從這些動物中收集肺，腎，肝和心臟的一小部分進行測試。

制備樣品，在提取DNA 之前，將皮膚樣品置于磷酸鹽緩沖液（1X PBS）中1h。一塊（約1.3cm2用剪刀將每個內部器官（肝，腎，心臟和肺）切成小塊，并匯集在一起（總量不超過5g）。使用研缽和研棒，少量研磨加入8mL 1×PBS 的樣品。將樣品（皮膚或合并的內部器官）勻漿。勻漿后，將漿液倒入15mL EP 中，并以8000 rpm 離心10min。將所得的上清液中提取DNA。試劑盒還可用于從血液樣本中提取DNA。研缽和研棒之間用漂白劑消毒。

4.2 實驗室檢測抗體檢測：采集全血，分離血清用于抗體檢測，可采用病毒中和試驗、酶聯免疫吸附試驗等方法。

4.3 病毒中和試驗使用標準程序測試血清樣本（n= 80），該程序將中和指數確定為首選方法。針對恒定稀釋的測試血清滴定病毒株。以此方式，需要更大體積的測試血清，但是消除了確保50%組織培養物感染劑量（TCID50）為100 的困難。根據可用的OIE 程序，使用羊睪丸（LTe）細胞在96 孔板中進行測試。

病原檢測：采集皮膚結痂、口鼻拭子、抗凝血等用于病原檢測。病毒核酸檢測可采用實時PCR 等方法，病毒分離鑒定可采用細胞分離培養病毒，動物回歸試驗等方法。

4.4 實時PCR 測試內部器官樣本進行檢測。使用Taq 聚合酶，10x PCR 緩沖液，50mM MgCl 2 和10mM dNTPs 制備PCR 主混合物。將總共5μL 提取的樣品DNA 或模板對照添加到15μL 制備的預混液中，總體積為20μL。使用對應的熱循環條件，在PCR 儀器上進行反應。在樣品測試之前，將陽性模板對照（PTC）從1pg/μL 連續稀釋至0.001fg/μL，并在PCR 儀器上運行。合成循環閾值（C T）vs. PTC濃度曲線的對數給出3.76的斜率，對應于92%的擴增效率（每個循環100%加倍）。根據標準曲線，在后續測量中使用濃度為1 fg/μL 的PTC。

5 控制措施

對患病動物的治療因情況而異，但通常包括使用碘對皮膚病變進行消毒以及用磺胺治療繼發性細菌感染。采取預防措施，包括控制動物的活動以及限制車輛進入受影響農場的交通。