骨關節炎不同表型動物模型的選擇與制作

孫潔，姜萍，陳宗銳

1山東中醫藥大學，濟南250014；2山東中醫藥大學附屬醫院

骨關節炎（OA）是一種與遺傳、創傷、代謝、應力改變、炎癥等多因素相關的關節退行性疾病，好發于中老年人，以關節軟骨退變、骨質增生為病理特征，臨床表現為關節疼痛、腫脹、僵硬、活動受限等，最終可致關節功能障礙和殘疾。隨著人口老齡化和肥胖患病率的增加，髖和膝關節OA成為全球第11大致殘原因［1］，造成沉重的經濟及社會負擔。目前OA的治療僅限于對癥，尚缺延緩病情進展的藥物，其病理機制及治療靶點、藥物亟待研究。新近研究表明，OA并非是單純的一種疾病，而是存在著不同表型，表型間存在的差異顯著影響預防及治療的精準性。而OA的慢病性質及人類受試者的個體差異性體現了以人為對象進行實驗研究的局限性，因此要深入研究不同表型OA具體病理機制及有效藥物治療方法，需要依據不同表型特點建立合理、穩定的實驗動物模型。我們查閱文獻發現，目前用于OA研究的動物模型多種多樣，但缺乏對于不同表型動物模型的歸納總結、比較分析。本文參考2011年柳葉刀OA分型［2］，對創傷性、代謝性、衰老性、遺傳性、疼痛性5種表型OA的動物選擇與造模方法利弊進行分析，為OA分型造模的研究提供參考。

1 動物的選擇

動物模型應優先選擇機能、代謝、結構、疾病特點與人類相似的動物，同時考慮動物護理、成本、可操作性、疾病進展和對特定治療的反應［3］。

1.1 小型動物 小型動物多用于研究OA發病機制和病理過程，具有更易獲取、成本更低、研究周期更短的優勢。由于某些藥物在小動物模型與人體實驗中的效果并不完全相同，小型動物常作為OA治療干預的第一個篩選模型。

1.1.1 小鼠 基因組測序顯示，平均85%的蛋白質編碼基因在人類和小鼠高度一致［4］，故基因調控誘導的遺傳性OA表型研究多選用小鼠造模，可對其進行基因修飾或培育對OA敏感的品系。小鼠多用于OA分子水平研究，例如促炎細胞因子對OA發展的影響［5］。完成實驗所需時間長短取決于動物的骨骼成熟程度，小鼠骨骼成熟周期較短，約為10周［6］，適于短期實驗。膝關節在生物力學和解剖結構上與人類有一定相似性，多用于膝骨關節炎（KOA）研究，但其關節腔較小，平均軟骨厚度至少比人類小70倍［7］，手術操作及指標取樣檢測存在難度，因此多用于塑造非手術誘導的OA模型。

1.1.2 大鼠 大鼠關節腔更大、軟骨及骨層更厚，手術、灌胃及關節內操作較簡便，可誘導部分甚至全層軟骨缺損的KOA模型，多用于基因治療、干細胞移植、人工軟骨植入和局部生長因子治療研究［8］，因其反應靈敏，還可用于疼痛觀察及藥物反應、KOA與神經系統相關性研究［9］。

1.1.3 豚鼠 豚鼠與人類OA的組織病理學相似度非常高，具有類似的評分體系，且關節內生物標志物軟骨寡聚基質蛋白、硫酸角質素易于檢測［10］，適用于預防性治療的研究。另外，豚鼠存在自發性OA，對研究衰老型OA有一定價值。

1.2 中大型動物 中大型動物如兔、犬、豬等，其解剖結構與人類相似，有些動物存在自發性OA，但實驗成本較高、周期較長，多用于臨床前實驗確認藥物療效［7］。

1.2.1 兔 兔的體型較大，易于標本提取及指標觀察，尤其適于早期OA研究，軟骨未發生缺損情況下即可評估早期OA［11］。兔關節腔較大，利于手術操作，采用前交叉韌帶切斷法（ACLT）構建的兔OA模型Mankin評分分值較高，是研究OA軟骨退變較為理想的模型［12］。但由于兔具有很強的自愈能力，在模擬OA發生及發展進程方面存在一定局限性，且膝關節長期屈曲，在步態及生物力學方面與人類存在差異，關節組織結構和分布也與人類不同，不適合功能性研究。

1.2.2 犬 犬的膝關節結構與人類相似，OA病因、癥狀與治療方法亦與人類相似性較高，特別是胃腸道結構及生理機能與人類相似，尤其適合OA腸內療法的研究［13］。犬的關節腔更大，利于手術操作及組織樣本提取，可應用關節鏡及MRI檢查。但犬作為寵物，用于實驗研究仍存在爭議，不易通過倫理審查。

1.2.3 羊、豬、馬 羊的半月板較大，且OA半月板損傷情況與人類接近，適于OA半月板退變的研究，是ACLT法誘導OA的最佳動物模型［14］，多用于臨床前實驗。其中山羊膝關節的解剖結構最接近人類，軟骨層更厚，適合軟骨修復的相關研究。需要注意的是，反芻動物消化系統的特殊性可能對藥物實驗存在影響。豬軟骨層較厚，適于軟骨觀察研究，馬的掌指關節與人膝關節有許多相似之處［7］，但二者成本過高，較少用于OA造模。

2 不同表型OA造模方法

2.1 創傷性OA表型造模方法 創傷性OA主要與機械應力相關，可通過侵入性或非侵入性方式快速誘發。

2.1.1 侵入性誘導法 通過關節腔內侵入性操作迅速誘導OA，但需注意有創操作帶來的額外損傷及可能的感染所引起的混淆效應。

ACLT具有操作簡單、結構破壞小的優勢，是目前最常用的手術造模方法。由于ACLT主要通過打破關節穩定性誘導軟骨退變，相較半月板切除（MMT）術誘導的OA病變進程更緩慢，故在藥學研究中的易用性更佳。劉振龍等［15］對兔行ACLT并剪斷2 mm以防愈合，4周后組織學評分判斷軟骨損傷處于早期，并指出MANKIN評分與OOCHAS評分均可用于OA評價，而后者可能更適于評價早期OA軟骨損傷。此外，低幅高頻振動及患肢負重鍛煉均可加速ACLT誘導的大鼠OA進程、縮短實驗周期［16-17］。

MMT誘導的OA進程較ACLT快，故適于短期研究，大鼠和豚鼠是MMT最常用的動物。張榮凱等［18］切除大鼠膝關節內側半月板及內側副韌帶造模，4周內改變類似人類早期OA，是研究早期OA的理想模型。

改良Hulth法是在傳統Hulth法基礎上保留后交叉韌帶或內側副韌帶及后交叉韌帶的手術造模方法，造模成功率高，是目前常用的造模方法，適于中早期OA研究［19］。方銳等［20］在改良Hulth法基礎上強迫兔運動，觀察到軟骨退變早期代償性增生至失代償后軟骨細胞和基質減少、軟骨變軟到剝脫缺失的全過程，與單一改良Hulth法比較，大大縮短了造模周期。

閉合關節刻痕法創傷較小、炎癥輕微，被認為是觀察早期OA變化，研究軟骨保護及修復治療較為理想的模型。李釗等［21］使用小針刀在股骨髁軟骨面、臏軟骨及脛骨平臺上閉合刻痕，不傷及半月板，術后強迫運動，5周后得到較為理想的OA模型。

2.1.2 非侵入性誘導法 通過體外沖擊誘導關節內結構損傷，可避免侵入性操作伴隨的感染及并發癥，減少誤差對實驗結果的影響。

關節內脛骨平臺骨折法由壓頭提供沖擊力致關節閉合骨折，可調整力度控制病變嚴重程度，適用于研究急性損傷或骨折后早期OA，不適于研究慢性或低能量沖擊損傷OA［22］。

循環關節軟骨脛骨壓縮法通過向后膝關節施加軸向負荷使脛骨相對于股骨向前位移，是研究慢性過度使用損傷對OA影響的首選模型［14］。有研究發現，使用此法造模5 d后6 N負荷誘導輕度滑膜炎，9 N負荷致前交叉韌帶撕裂、重度滑膜炎及異位軟骨形成［23］，一段時間的重復壓縮后可用于研究軟骨下骨變化［24］。

脛骨壓縮超載法采用單一機械循環加壓誘導膝關節損傷，適用于高能量沖擊創傷及早期OA研究。CHRISTIANSEN等［25］使用此法造模，發現1周內骨小梁迅速大量丟失，第4周時快速恢復、關節間隙變窄，8周后顯示為輕度OA。

2.2 代謝性OA表型造模方法 代謝性OA主要與機械應力、脂肪因子、高血糖、雌激素、孕酮失衡相關［2］，以飲食誘導的肥胖動物模型及卵巢切除法為主，可用于肥胖、糖尿病、雌激素失衡相關OA研究。

高脂飲食誘導模型不破壞關節結構完整性及穩定性，接近人類肥胖型OA發病機制，在肥胖相關OA中最為常用。BARBOZA等［26］發現，高脂飲食誘導雄性C57BL/6J小鼠發病的時間進程約為20周，導致了明顯的肥胖、葡萄糖耐受不良及包括骨贅和軟骨潮汐復制在內的早期OA。考慮到四足嚙齒類動物與人類運動方式不同所致的負荷差異，SON等［27］在高脂飲食誘導基礎上使用跑步機訓練小鼠兩足行走，建立了更接近肥胖型人類關節負荷的OA模型。

卵巢切除法通過影響雌激素及其類似物生成來誘發OA，適用于絕經、骨質疏松相關的OA研究。H?EGH-ANDERSEN等［28］通過切除卵巢誘導SD大鼠OA，發現代表骨吸收的CTX-Ⅰ及軟骨變化的CTX-Ⅱ水平與關節最終退變呈顯著相關性。王文勝等［29］在切除雙側卵巢基礎上對大鼠進行上坡疲勞性跑臺訓練，4周后軟骨Mankin評分達到損傷標準，較單純卵巢切除造模法的效率顯著提高。

2.3 衰老性OA表型造模方法 衰老性OA與年齡、軟骨細胞凋亡等因素有關，目前以自然衰老的自發性OA或敲除抗衰老基因配合手術造模為主。其中具有自發性OA的Hartley豚鼠因組織病理學改變與人類相似度高且生物標志物易于檢測而較為常用［30］。于斐等［31］通過敲除抗衰老基因沉默信息調節因子（SIRT1）配合單膝關節ACLT+MMT建立高齡小鼠KOA模型，模擬老年OA，可用于研究年齡相關OA及藥物長期治療的有效性。

2.4 遺傳性OA表型造模方法 遺傳性OA主要與基因相關。曹斌等［32］篩選總結轉基因動物模型文獻，發現敲除小鼠Col11a1、Col2a1基因，或Del1、Ⅱ型、Ⅸ型膠原基因突變，或軟骨基質基因缺陷，均可誘發OA。此外，銅轉運基因缺陷、MMP-13基因過表達、組織特異性BMP-1a型受體缺乏，以及ADAM-15基因、MMP-14基因、IL-6基因、Mig-6基因、A-1整合素基因、纖維調節素和基膜聚糖基因雙鏈、纖維調節素和二聚糖基因單鏈或雙鏈的敲除亦可導致OA［33］，可用于遺傳性OA發病機制及藥物療效研究。

2.5 疼痛性OA表型造模方法 疼痛性OA主要與炎癥、骨破壞及異常疼痛相關［2］，可采用關節腔注射法、寒冷刺激法及血液循環阻斷法造模。

關節腔注射法通過改變腔內微環境誘導OA，具有造模時間短、操作簡便的優勢。碘乙酸鈉是目前OA關節腔注射最常用的化合物，通過抑制Krebs循環的甘油醛-3-磷酸脫氫酶誘導軟骨細胞凋亡，引起軟骨基質改變、軟骨降解丟失、滑膜炎癥等病理改變。POMONIS等［34］報道，碘乙酸鈉較木瓜蛋白酶能更好地誘導以疼痛為主癥的慢性關節變性，且疼痛、關節退變程度與注射時間、濃度相關，是研究OA疼痛機制、炎癥、檢測藥物療效的經典方法。木瓜蛋白酶注射誘導的OA病變速度快，可模擬軟骨破壞終末階段。汪宗保等［35］以2%木瓜蛋白酶與0.03 mol/L左旋半胱氨酸的混合液注入大鼠關節腔，注射后4～6周成功誘導早期OA。膠原酶通過分解軟骨細胞間基質膠原蛋白誘導OA。劉軍等［36］采用關節腔注射膠原酶誘導的KOA類似于老年鼠自發OA，使用Ⅱ或Ⅳ型膠原酶造模3 d后即可觀察到OA病理改變。

寒冷刺激血管收縮可致血運不暢，組織缺血缺氧，關節液成分改變，釋放炎癥因子誘發OA。林強等［37］以石膏將大鼠四肢每日4 h固定于4℃涼水誘導OA，6周后觀察到軟骨損傷，血清及滑膜中IL-1β、TNF-α、PGE2、COX-2、γ干擾素水平均升高。該造模方法常用于中醫陽虛寒凝、寒濕痹阻型OA的實驗研究。

血循阻斷法通過阻斷血流導致骨內高壓，關節內靜脈回流受阻、動脈灌注不足，軟骨組織營養供給不足誘發OA。戴七一等［38］結扎動物臀下靜脈、股靜脈及大隱靜脈，8周后建立了早中期KOA動物模型。此種造模方法亦可用于中醫氣滯血瘀型OA研究。

OA分型化可提高研究的針對性與準確性，研究者可根據不同表型實驗需要，結合動物及造模方法優缺點，選擇最適宜的動物用于研究。但目前尚無OA造模公認的操作及評分標準，存在較大的探索空間。