納米技術(shù)在藥物制劑研究中的應(yīng)用

宋元博 張婷 姚沛孚

摘要：目的 利用小分子納米藥物制備技術(shù)應(yīng)用于新型具有靶向性的抗粘附肽和具有免疫抑制活性的尿毒素三肽修飾的地塞米松納米制劑的研制。方法 選擇廣西中醫(yī)藥大學動物實驗中心成年雄性小鼠40只，均為耳后心肌移植小鼠模型。根據(jù)隨機雙盲法分組，分為納米組（n=20）、常規(guī)組（n=20），應(yīng)用抗粘附肽和尿毒素三肽修飾地塞米松合成地塞米松衍生物，鑒定結(jié)構(gòu)并表征其納米性質(zhì);完成抗粘附肽修飾和尿毒素三肽修飾地塞米松的納米制備。脛骨Accelrys公司的MS7.0軟件的Mesocale Simulation模型計算，該類可降解的多肽衍生物可自組裝形成納米顆粒。結(jié)果 納入技術(shù)組小鼠發(fā)生骨質(zhì)疏松、急性毒性顯著低于常規(guī)組，而其保留抗炎活性顯著高于常規(guī)組（P<0.05）。結(jié)論 新型小分子納米制備技術(shù)，可改變臨床抗腫瘤藥物溶解度差的問題，完善其臨床給藥方式，避免大分子載體本身的漏藥、代謝毒性等副作用，具有廣闊的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：應(yīng)用前景;藥物制劑;納米技術(shù);地塞米松納米制劑

【中圖分類號】R97 【文獻標識碼】A 【文章編號】2107-2306（2021）16-01

患者長期使用地塞米松類糖皮質(zhì)激素，會導致代謝和水鹽代謝紊亂，出現(xiàn)類腎上腺皮質(zhì)功能亢進綜合征，如浮腫、高血壓、動脈粥樣硬化和血栓性疾病癥狀[1];另一種嚴重的副作用是骨質(zhì)疏松和椎骨壓迫性骨折;骨質(zhì)疏松及椎骨壓迫骨折是各種年齡患者應(yīng)用糖皮質(zhì)激素治療中嚴重的合并癥。這可能與糖皮質(zhì)激素抑制成骨細胞活性，增加鈣磷排泄，抑制腸內(nèi)鈣的吸收以及增加骨細胞對甲狀旁顯示的敏感性等因素密切相關(guān)。為規(guī)避或降低副作用，目前國際學者一般發(fā)展地塞米松的大分子納米遞藥系統(tǒng)[2]。本研究通過優(yōu)化小分子結(jié)構(gòu)的方法合成地塞米松衍生物，發(fā)展小分子納米藥物。按照本項目方式，開發(fā)活性強、毒性小并具有可控納米結(jié)構(gòu)的新型免疫抑制劑先導結(jié)構(gòu)，具有重要意義，現(xiàn)報道如下。

1資料和方法

1.1 實驗動物 選擇廣西中醫(yī)藥大學動物實驗中心的雄性成年小鼠40只，體質(zhì)量25-30g，平均（27.5±2.1）g，均為耳后心肌移植小鼠模型。根據(jù)隨機雙盲法分組，分為納米組（n=20）、常規(guī)組（n=20），納米組體質(zhì)量25-30g，平均（27.5±2.2）g;常規(guī)組體質(zhì)量25-30g，平均（27.6±2.0）g，兩組小鼠的處理模型、平均體質(zhì)量等基本數(shù)據(jù)大體一致（P>0.05）。

1.2藥物設(shè)計 選擇糖皮質(zhì)激素地塞米松為先導結(jié)構(gòu)，應(yīng)用尿毒素三肽、RGD肽對地塞米松進行修飾;同時引入肽鏈可以改善化合物的溶解度，制備具有理想納米形貌（粒徑<200nm）的小分子目標化合物的納米體系，達到改善藥物溶解度及降低用藥劑量的目的。本項目采取尿毒素三肽（EDG、HGK、HGE）、含RGD肽及其逆序列肽分別連接到化合物的（圖1 結(jié)構(gòu)E）Lys的α羧基和e氨基上的策略，設(shè)計本項目的目標化合物。

1.3 藥物的合成與鑒定

修飾的地塞米松衍生物的合成步驟：（1）在DMSO中，NaH催化地塞米松17位羥乙酰基的羥基與溴乙酸乙酯脫HBr，將17位羥乙酰基轉(zhuǎn)化為乙氧羰基甲氧乙酰基。在NaOH溶液中將17位乙氧羰基甲氧乙酰基轉(zhuǎn)化為17位羧甲氧乙酰基;（12）按照標準的液相接肽法，逐步接肽，將Boc-Lys的側(cè)鏈氨基與羧端游離的全保護肽的羧端偶聯(lián)，將L-Lys的羧端與α-氨基游離的全保護另一種肽的N端偶聯(lián)，制備全保護的八肽（或四肽、五肽），后在20%哌啶的DMF溶液中脫Fmoc制備N游離的保護肽Lys（R’2）-R’1;（3）在HATU、HOBt和NMM存在下，在無水DMF中，先將步驟1得到的地塞米松-17-羧酸與步驟2得到的Lys（R’2）-R’1偶聯(lián)，再在三氟乙酸中應(yīng)用三氟甲磺酸脫去全部保護基，制得多肽修飾的地塞米松衍生物。

1.4納米結(jié)構(gòu)表征：（1）測定平均粒徑：從目標化合物中選擇活性最好的三種化合物，采用應(yīng)用Malvern公司Zeta Sizer（Nano-ZS90）型激光納米粒度儀，連續(xù)五日測定其蒸餾水溶液（pH7.4、6.7、5.5）隨濃度（1um、0.1um、0.01um、1nm、0.1nm）、溫度（25°C、37°C、50°C）和時間（5天內(nèi)）的粒徑變化。（2）納米粒結(jié)構(gòu)測定：將活性最后的3種目標化合物配成不同濃度（1um、0.1um、1nm、0.1nm）的蒸餾水溶液、滴在特制銅網(wǎng)上，室溫自然揮發(fā)干，在透射電子顯微鏡（TEM、JEM-200CXJEOL，Tokyo，Japan）下用照片記錄形貌和尺寸。以已合成的DAK1a為例，其TEM圖片見圖3。

1.5 藥理活性評價：（1）采用耳后心肌移植小鼠模型評價地塞米松衍生物延長小鼠耳后移植心肌存活時間，并測量其股骨密度，評價其是否具有骨質(zhì)疏松的副作用;（2）稱取各組耳后心肌移植小鼠內(nèi)臟，計算臟體比，測量其血液中相關(guān)生化指標，初步評價其急性毒性。（3）為評價目標化合物是否保留抗炎活性，采用小鼠二甲苯耳腫脹炎癥模型體內(nèi)評價目標化合物的抗炎作用[3]。

1.6統(tǒng)計學方法 全部數(shù)據(jù)傳輸至SPSS21.0軟件系統(tǒng)分析處理，計數(shù)資料為卡方檢驗，P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠模型各項指標分析 納入技術(shù)組小鼠發(fā)生骨質(zhì)疏松、急性毒性顯著低于常規(guī)組，而其保留抗炎活性顯著高于常規(guī)組（P<0.05），見表1。

3 討論

近二十幾年來，臨床醫(yī)師使用地塞米松臨床用藥量逐年增加，地塞米松注射劑更是搶救垂危病人不可缺少的急救藥品，廣泛應(yīng)用于自身免疫性疾病、過敏、止吐、炎癥等疾病，特別是應(yīng)用于器官移植后的免疫排斥反應(yīng)[4-5]。器官移植中免疫排斥反應(yīng)是器官移植失敗的最主要因素，接受器官移植的患者，術(shù)后服用地塞米松類糖皮質(zhì)激素免疫抑制劑，是避免排斥反應(yīng)和延長移植器官存活時間的重要措施之一[6-8]。本項目利用小分子納米藥物制備技術(shù)，應(yīng)用于新型具有靶向性的抗粘附肽和具有免疫抑制活性的尿毒素三肽修飾的地塞米松鈉米制劑的研制。前期研究發(fā)現(xiàn)該類醫(yī)用納米制劑可降解、多肽衍生物可自組裝形成理想的納米顆粒（100-200nm）;本項目制備成的這類高效低毒、靶向性的納米制劑，應(yīng)用于終身服藥的免疫抑制移植治療中，本項目可確定目標化合物的最佳組合，提高化合物的水溶性、免疫抑制活性和卡箍有活性，降低化合物等毒副作用;同時通過優(yōu)化小分子結(jié)構(gòu)的方法合成地塞米松衍生物，發(fā)展小分子納米藥物，深入研究這類綴合激素化合物的構(gòu)效關(guān)系;同時可通過人為控制pH、溫度或濃度，使目標化合物具有適宜的納米結(jié)構(gòu)，降低藥物的副作用。

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項目名稱1：廣西中醫(yī)藥大學面上項目（No.2018MS031）

項目名稱2：廣西中醫(yī)藥大學面上項目（No.2019MS035）