青春期慢性社交挫敗應激致小鼠認知功能障礙及內側前額葉皮質髓鞘損傷

徐穎娟，方澤漫，吳彩茹，黃慶軍，張瀚迪

(汕頭大學精神衛生中心，廣東 汕頭 515065)

社交挫敗應激動物模型廣泛應用于抑郁癥等應激相關精神疾病的研究[1]。既往研究顯示青春期或成年期社交挫敗小鼠前額葉皮層髓鞘含量減少[2-3]，動物表現出社交回避及抑郁樣行為[4]。青春期及成年期NG2細胞不斷分化成熟，參與髓鞘的穩態維持。這一過程也受到外界環境因素影響，目前認為這可能是神經可塑性的生物學基礎之一[5-6]。青春期小鼠經歷社交剝奪后表現為工作記憶損害、社交退縮，這些行為改變與前額葉髓鞘及少突膠質細胞損傷相關[5]。這些研究提示青春期應激經歷可能導致前額葉白質損傷及認知功能障礙。然而，青春期社交挫敗應激對少突膠質細胞系細胞和髓鞘的發育，以及認知功能的影響尚未深入探討。本研究探討青春期社交挫敗應激對小鼠執行功能、記憶以及少突膠質細胞系/髓鞘相關病理的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 21日齡青春期雄性BALB/c小鼠34只，8～9月齡CD-1(ICR)小鼠，均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司(動物合格證編號分別為 11400700178467 及 11400700178659)。BALB/c小鼠每籠4只飼養，CD-1小鼠單籠飼養，提供充足食物和水，實驗前適應環境3 d。飼養房室溫保持在(23±2)℃，濕度維持在(50±5)%，保持12 h光照和12 h黑暗交替，動物自由進食、飲水。本研究通過汕頭大學動物倫理委員會審批(倫理號SUMC2016-117)。

1.1.2 主要試劑與儀器 髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)、5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2'-deoxyuridine，BrdU)購自美國Santa cruz公司，β-actin抗體購自中國新晉生物公司，BrdU抗體、NG2抗體、腺瘤性結腸息肉蛋白(adenomatous polyposis coli，APC)抗體購自美國Chemicon公司、離子化鈣離子結合接頭分子1(ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba1)抗體購自日本Wako公司，皮質酮酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自瑞士Enzo Life Sciences公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗流程 BALB/c小鼠隨機分為對照組和應激組，每組17只。應激組在產后第25～42天接受慢性間歇性社交挫敗應激，應激期間每3 d應激后停止1 d，對照組不接受任何應激。應激結束后第1～3天進行迷盒實驗，于第4～5天麻醉后取血，腦組織用于ELISA、Western blot及免疫組化檢測。應激結束后第1～4天下午16:30～18:00腹腔注射BrdU，劑量為100 mg/kg。

1.2.2 社交挫敗應激 將BALB/c實驗鼠置于CD-1小鼠籠中，接受軀體攻擊2 min，然后將BALB/c小鼠置于籠中與CD-1小鼠在軀體上隔離，但實驗鼠仍能感受到CD-1攻擊鼠的氣味、目光和聲音，該過程持續30 min，最后將BALB/c實驗鼠移回原籠內。

1.2.3 迷盒實驗 該實驗用于檢測嚙齒類動物的認知功能，實驗方法參考Ben等[7]的報道。迷盒主要由明區及暗區(目標區)組成，利用嚙齒類動物趨暗天性，在明區進入暗區的通道中設置不同的障礙，改變進入暗區的難易程度，通過檢測小鼠從實驗開始到首次進入暗區的時間(潛伏期)評估它的執行功能、短期記憶及長期記憶。實驗分3 d，3個測試/d，共進行9個測試，記為第1天(T1、T2、T3)；第 2天(T4、T5、T6)；第 3天(T7、T8、T9)。迷盒實驗條件設置見表1。每組10只小鼠，將小鼠置于明區遠離門的一端，讓其自由活動，記錄其進入暗區所用的時間。如果超過5 min仍未進入暗區，則記錄時間為300 s。

表1 迷盒實驗條件設置

1.2.4 免疫組化 麻醉取腦后用多聚甲醛固定，蔗糖溶液脫水用于冰凍切片。切片加入NG2抗體(1∶200稀釋)，Iba1抗體(1∶1 000稀釋)，APC抗體(1∶200稀釋)，4℃孵育過夜，生物素化二抗室溫下孵育1 h，加入ABC混合液，磷酸鹽緩沖液清洗后二氨基聯苯胺顯色，酒精脫水及二甲苯透明封片保存，顯微鏡下觀察。BrdU免疫組化檢測步驟：加入BrdU抗體，4℃孵育過夜，生物素化二抗室溫下孵育1 h，加二抗，封片固定，鏡下200倍分析。每只鼠在內側前額葉皮質(medial prefrontal cortex，mPFC)區 (bregma+1.98 mm～+1.54 mm)間隔150 μm取3張腦切片做定量分析，結果以細胞數量/mm2表示。

1.2.5 Western blot 腦組織在RIPA裂解液中勻漿后離心10 min(13 400×g，4℃)取上清液。按BCA試劑盒測定總蛋白濃度。蛋白樣品經電泳分離后，電轉至PVDF膜。室溫孵育1.5 h后加入相應一抗山羊抗MBP(1∶1 000稀釋)，鼠抗β-actin(1∶5 000稀釋)孵育過夜，然后分別加入相應二抗，室溫孵育1 h，ECL化學發光顯影定影。

1.2.6 ELISA 小鼠經異氟烷吸入麻醉至淺反射消失后，快速內眥取血，室溫靜置1 h，800×g，4℃離心10 min后按照ELISA試劑盒檢測說明書進行檢測。

1.3 統計學分析

應用SPSS 19.0統計軟件進行分析，正態分布的計量資料以±s表示，2組間比較用獨立樣本t檢驗；偏態分布的2組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 青春期慢性社交挫敗應激損害小鼠短時記憶及長時記憶

在迷盒實驗的T3及T4測試，應激組首次進入目標區的潛伏期比對照組延長，差異具有統計學意義(P＜0.05)。而在其他測試中，2組差異沒有統計學意義(均P＞0.05)。見表2。

表2 應激組與對照組首次進入目標區的潛伏期比較 (s)

2.2 青春期慢性社交挫敗應激降低mPFC腦區MBP的表達

在mPFC腦區，應激組小鼠MBP蛋白的表達較對照組降低，差異有統計學意義(P＜0.05)。應激組小鼠海馬區MBP蛋白的表達差異沒有統計學意義(P＞0.05)。見圖1。

圖1 應激組與對照組MBP表達比較

2.3 青春期慢性社交挫敗應激不改變mPFC腦區少突膠質細胞系細胞及增殖細胞數量

應激組小鼠mPFC腦區OPC細胞(NG2陽性)、OL細胞(APC陽性)以及BrdU陽性細胞數量與對照組比較，差異沒有統計學意義(P＞0.05)。見圖2。

圖2 應激組與對照組少突膠質細胞系細胞及增殖細胞數量比較

2.4 青春期慢性社交挫敗應激不影響mPFC腦區小膠質細胞數量

mPFC腦區小膠質細胞(Iba1陽性細胞)胞體較小，突起呈高度分枝狀，細胞均勻散在分布，應激組小鼠小膠質細胞數量與對照組比較差異沒有統計學意義(P＞0.05)。見圖3。

圖3 應激組與對照組小膠質細胞形態與數量比較

2.5 青春期慢性社交挫敗應激對應激相關生理指標的影響

應激組小鼠應激前體重和對照組差異無統計學意義(P＞0.05)。應激結束后，應激組小鼠體重低于對照組，腎上腺質量高于對照組，差異均具有統計學意義(均P＜0.001)。而應激組和對照組小鼠外周血皮質酮含量差異無統計學意義(P＞0.05)。見表3。

表3 應激組與對照組應激相關生理指標比較 (n=17，±s)

表3 應激組與對照組應激相關生理指標比較 (n=17，±s)

組別對照組應激組t值P值應激前體重/g 13.61±0.62 12.73±1.49 1.452 0.185應激后體重/g 22.90±0.45 17.56±1.15 11.414＜0.001腎上腺質量/mg 5.29±1.60 9.29±1.50-4.86＜0.001皮質酮含量/(μg/mL)12.34±3.95 17.38±9.97-1.033 0.345

3 討論

本研究顯示青春期小鼠在社交挫敗應激后，mPFC腦區MBP表達下降，而在海馬區沒有改變，提示社交挫敗應激降低前額葉MBP表達。既往研究發現青春期經歷慢性社會隔離應激的小鼠其前額葉MBP、髓鞘相關糖蛋白mRNA水平降低，髓鞘厚度變薄[5]，成年期慢性不可預見應激[8-9]或社交挫敗應激[10]降低前額葉皮層髓鞘相關基因轉錄及表達。這些結果與本研究發現一致，表明不同類型的慢性應激均對前額葉髓鞘造成損害。Andersen等[11]臨床研究發現14～16歲青少年遭受性虐到后前額葉皮層灰質減少，而海馬則幾乎沒有改變。這與本研究結果類似，表明青春期慢性應激對前額葉髓鞘有特異性損害。

本研究發現慢性青春期社交挫敗應激導致小鼠T3、T4測試時進入靶區域的潛伏期延長，顯示存在短時及長時記憶損害。記憶功能受到海馬、mPFC等多個腦區調控，任何一個相關腦區損傷都可能導致記憶障礙，而本研究中mPFC區髓鞘損傷，海馬髓鞘沒有損傷，表明前額葉髓鞘損傷可能和記憶受損存在相關性。但尚需進一步的干預研究探討兩者間的因果關系。

本研究發現前額葉MBP蛋白水平降低，OPC及OL數量無改變，BrdU細胞數量無改變。提示髓鞘MBP的降低不是由于OPC增殖及分化異常引起的。既往一些研究觀察了社交挫敗應激對OPC及OL的影響，但研究結果并不一致。青春期社交隔離小鼠出現mPFC腦區MBP表達下降，但少突膠質細胞數量沒有變化，這與少突膠質細胞組蛋白乙?；统Ｈ旧|增加有關[12]。臨床證據表明幼年逆境不影響少突膠質細胞的增殖，但減少了扣帶回皮層白質中的成熟少突膠質細胞數量，這與少突膠質細胞DNA甲基化降低有關[13]。以上說明髓鞘損傷可能通過表觀遺傳學調控。但目前應激對海馬的髓鞘機制研究還較缺乏。

本研究發現青春期社交挫敗應激不影響前額葉小膠質細胞數量及形態。但尚不能排除小膠質細胞參與應激所致的髓鞘損傷過程的可能。本研究采用Iba1檢測小膠質細胞的激活狀態，尚需采用其他激活狀態標志物進一步地探討。應激結束后第4天測量外周血皮質酮水平，應激組和對照組差異無統計學意義，表明青春期慢性應激不改變皮質酮基礎水平。腎上腺在慢性應激條件下分泌糖皮質激素，在體外研究中發現糖皮質激素可導致髓鞘長度變短及MBP減少[14]，在體內研究中發現糖皮質激素對髓鞘形成有促進[15]或抑制[16]作用，同時高劑量糖皮質激素可降低髓鞘MBP的表達，而低劑量未抑制髓鞘MBP的表達[17]，這可能與髓鞘所處環境及糖皮質激素劑量不同有關，因此糖皮質激素高劑量毒性作用可能是mPFC腦區MBP表達降低的分子機制，我們計劃在未來的研究中探討這一可能性。

綜上所述，青春期慢性心理應激導致認知功能損害及前額葉腦區髓鞘損傷，髓鞘損傷可能是認知功能下降的生物學機制。應激所致的髓鞘損傷可能涉及下丘腦—垂體—腎上腺軸激活及小膠質細胞介導的炎癥反應，其具體機制尚需進一步研究。