Ki-67、ToPoⅡα在宮頸病變中表達的比較及檢出HSIL的價值分析

蔣朋朋 趙向榮 柯小寧

宮頸癌是女性最為常見的惡性腫瘤之一。據研究統計，2018年全球估計有311365人因宮頸癌而致死，其中大概90%發生于發展中國家[1]。而宮頸病變是正常宮頸上皮發展至宮頸癌的重要中間階段，其分級診斷在臨床上較為困難。因此常需要借助分子生物學標志物輔助診斷，提高宮頸病變診斷的準確性[2]。Ki-67主要表達于增殖細胞的細胞核中，是評估細胞增殖的較好指標，常用于宮頸病變的分級診斷[3]。TopoⅡα是DNA拓撲異構酶的一種，能調節核酸結構,是DNA進行復制及轉錄的重要核酶[4]。目前TopoⅡα研究熱點主要在于其可作為蒽環類藥物的靶酶，常用于腫瘤耐藥時預測蒽環藥物化療的敏感度[5]。但TopoⅡα的表達在細胞增殖和分裂中起著重要的作用，其蛋白水平的過表達反映細胞的增殖狀態，也是一個特殊的細胞增殖標志物[6]。本研究通過免疫組化法研究Ki-67、TopoⅡα這兩種細胞增殖標志物在宮頸病變組織中的不同表達情況并作比較，同時探討其在檢出宮頸高級別病變方面的價值。

材料與方法

1.一般資料：選取2018年1月～2019年1月因宮頸病變就診于邯鄲市中心醫院門診或住院部，進行宮頸活檢或錐切的患者113例，作為觀察組。其中CINⅠ46例、CINⅡ33例、CINⅢ34例。同時隨機選取同一時段因子宮良性病變行手術治療，病理診斷為宮頸正常組織者45例，作為對照組。入選患者年齡為35～65歲，平均年齡46.0±8.3歲，各組年齡比較差異無統計學意義。納入標準：①35歲≤年齡≤65歲；②此前未接受過放化療或分子靶向治療；③臨床、病理資料完整；④既往無宮頸癌及其他惡性腫瘤病史；⑤兩名高年資病理醫生復核診斷的病理分級結果一致。排除標準：①年齡<35歲或>65歲；②經期、孕期、哺乳期的女性；③臨床、病理資料不完整；④有腫瘤相關的放化療或其他基因靶向治療史；⑤合并有重要臟器功能損傷；⑥兩名病理醫生的復核診斷結果不一致。本研究開始前均獲得患者或家屬的知情同意。本研究經邯鄲市中心醫院醫學倫理學委員會批準通過。

2.研究方法：(1)試劑選擇：所有符合條件的標本均已使用10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋。選取符合標準的組織，對其蠟塊進行4μm厚連續切片，應用免疫組織化學SP法染色，DAB顯色，最后結果使用光鏡進行觀察。Ki-67兔抗人型單克隆抗體、鼠抗人型單克隆ToPoⅡα抗體購自上海信裕生物科技有限公司，免疫組化相關試劑購自上海如吉生物科技發展有限公司。實驗操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。(2)免疫組化步驟:常規石蠟切片，做好標記，68℃烤箱烤片2h，二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水, 采用高壓鍋高溫修復抗原，3%雙氧水滅活內源性過氧化物酶，每張切片上滴加適量一抗，4℃恒溫過夜，再加入生物素標記的二抗，37℃恒溫培養箱放置1h，DAB顯色，蘇木精溶液復染，標本脫水、透明，干燥后中性樹膠封片[7]。每步均經準確的時間及恰當的溫度孵育，均使用PBS緩沖液進行沖洗。陰性對照選擇PBS染色替代一抗，陽性對照以宮頸癌染色結果為標準。

3.結果判讀:Ki-67、ToPoⅡα的陽性表達均為細胞核內出現棕黃色或褐色顆粒。在低倍光鏡下觀察，選擇5個陽性病變典型的區域，再在高倍鏡下計數200個細胞中的陽性細胞數，取5個陽性細胞比例的均值確定最終陽性細胞比例。結果分為陰性(-):陽性細胞比例≤5%；弱陽性(+): 6%<陽性細胞比例≤25%; 中度陽性(++):25%<陽性細胞比例≤50%；強陽性(+++):陽性細胞比例>50%。

4.統計學方法:采用SPSS 21.0統計學軟件對數據進行統計分析。計數資料采用百分比(%)表示，組間比較采用χ2檢驗，期望計數<5時使用連續校正法或Fisher精確概率法計算。Ki-67、ToPoⅡα的陽性表達與宮頸病變程度的一致性采用Spearman等級相關性分析。Ki-67、ToPoⅡα檢出HSIL的敏感度、特異性、準確率、陽性預測值、陰性預測值的比較采用配對χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.Ki-67、ToPoⅡα在各組中陽性表達率的比較：Ki-67在對照組、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ組中的陽性表達率逐漸升高，分別為15.56%、45.65%、69.70%和94.12%，組間比較差異有統計學意義(χ2=53.03，P<0.05)。ToPoⅡα在各組中的陽性表達率依次為11.11%、34.78%、54.55%、88.24%和96.67%，組間比較差異有統計學意義(χ2=57.97，P<0.05)，詳見表1、圖1。

表1 各組中Ki-67、ToPoⅡα的陽性表達情況[n(%)]

圖1 各組中Ki-67、ToPoⅡα的陽性表達情況(免疫組化，×200)

2.Ki-67、ToPoⅡα的陽性表達率與宮頸病變級別相關性比較：Ki-67、ToPoⅡα的陽性表達水平均與宮頸病變嚴重程度具有一致性，Spearman相關系數分別為0.670和0.647。即宮頸病變的級別越嚴重，Ki-67、ToPoⅡα的陽性表達率越高。兩者均能反映宮頸病變的嚴重程度，一致性相當(P=0.000)。

3.Ki-67、ToPoⅡα檢出HSIL的診斷價值比較：HSIL包括CINⅡ、CINⅢ級病變，Ki-67、ToPoⅡα以檢出CINⅡ及CINⅢ級病變為陽性。陽性檢出情況詳見表2。其中在67例高級別病變組織中，Ki-67陽性例數55例，ToPoⅡα陽性例數48例。依據上述表格分別計算出Ki-67、ToPoⅡα檢出HSIL敏感度、特異性、準確率、陽性預測值和陰性預測值，詳見表3。Ki-67的敏感度、陰性預測值略高于ToPoⅡα，差異無統計學意義(P>0.05)。ToPoⅡα的準確率及陽性預測值略高于Ki-67，差異無統計學意義(P>0.05)。而ToPoⅡα的診斷特異性高于Ki-67，差異有統計學意義(P<0.05)。即在敏感度、準確率、陽性預測值、陰性預測值等方面，Ki-67與ToPoⅡα的診斷價值比較，差異無統計學意義。但是在特異性方面，ToPoⅡα的診斷價值略高于Ki-67，差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 Ki-67、ToPoⅡα檢出HSIL的陽性例數(n)

表3 Ki-67、ToPoⅡα的檢出HSIL的診斷效能比較[n/n(%)]

討 論

近年來，通過各種分子標志物協助腫瘤的診斷或分級成為各種腫瘤的研究熱點。宮頸癌是一種女性常見的惡性腫瘤，而惡性腫瘤的特征是在細胞遺傳過程中細胞分裂增強和無限制的分裂。在反映細胞增殖相關的核抗原中，應用最為廣泛的是Ki-67。長期以來，關于ToPoⅡα的研究主要在腫瘤化療的耐藥性或者療效的評估方面[8]。但有研究發現，ToPoⅡα的表達與Ki-67具有相關性，也可以反映腫瘤細胞的增殖狀態[9]。研究顯示，在臨床治療及判斷預后等方面ToPoⅡα比Ki-67更具有特異性[10]。本研究旨在比較Ki-67、ToPoⅡα在各宮頸組織中的不同表達水平，探討其對宮頸高級別病變的檢出效能。

Ki-67主要表達于增殖細胞的細胞核中,而在靜止期細胞不表達,是評估細胞增殖的較好指標[11]。Ki-67位于人類第10號染色體長臂，由兩條多肽鏈組成，其中一條為345kDa，另一條為395kDa[12]。它能夠識別細胞周期中核抗原上的一個抗原決定簇,在增殖細胞的G1、S、G2期表達,G0期不表達，與細胞的合成代謝有關[3]。Ki-67在細胞周期不斷的增殖過程中受協調機制控制，若調控機制發生異常，則機體表達呈現出增殖紊亂的狀態。因此Ki-67的高表達常表示細胞增殖活躍，可反映宮頸癌或者癌前病變[13]。盡管Ki-67已被用作細胞增殖的標志物和CIN分級的輔助物，但其參與的具體過程仍不明確[14]。

ToPoⅡα表達于細胞核,能調節核酸結構,是控制核酸生物功能的關鍵酶[15]。其可催化DNA雙鏈結構的復制，屬于DNA拓撲異構酶的一種。眾所周知，腫瘤的發生、發展是腫瘤細胞過度增殖造成的，而腫瘤細胞過度增生，必然涉及到DNA復制增加和DNA損傷修復功能增加。DNA拓撲異構酶是真核生物細胞調控過程中一種必不可少的核酶，可催化DNA鏈的斷裂和再結合，從而控制DNA的拓撲空間狀態，在調節DNA超螺旋結構過程中發揮著重要作用[16]。當拓撲異構酶發生突變或缺失時，則會導致基因的復制、染色體分離等缺陷，可導致嚴重疾病的發生[17]。因此，ToPoⅡα在惡性腫瘤細胞中的高表達不僅反映了增殖活性的增強，還反映了質的改變，常提示病變比較嚴重[18]。

本研究結果發現，Ki-67在對照組中的陽性表達主要在基底層及副基底層，隨著病變級別加重，Ki-67的表達層次逐漸由上皮下1/3層發展至上皮下2/3層及全層，陽性部位也由局灶陽性向彌漫陽性轉變，這與施絨賢等[19]研究結果一致。同樣，ToPoⅡα的陽性表達水平也隨著宮頸病變的升級，表達越來越強。并且，在檢出宮頸高級別病變方面，ToPoⅡα與Ki-67的敏感度比較，差異無統計學意義，但特異性較Ki-67高，差異有統計學意義，即在腫瘤細胞增殖方面ToPoⅡα的特異性優于Ki-67。但是由于本研究屬于小樣本研究，有待于擴大樣本量來進一步分析探討TopoⅡα與Ki-67在檢出宮頸高級別病變的效能比較。

綜上所述，TopoⅡα與Ki-67均可反映宮頸病變的級別，且呈正相關。但在檢出宮頸HSIL方面，TopoⅡα的特異性高于Ki-67，在臨床診斷上具有一定的指導意義。