異氟醚預處理通過降低肝臟caspase-1/caspase-11的表達減輕肝臟缺血再灌注損傷

王小瑩 申麗娟

1 重慶醫科大學附屬第三醫院麻醉科，重慶市 401120； 2 昆明醫科大學基礎醫學院病理學教研室

肝臟缺血再灌注損傷(Hepatic ischemia-reperfusion injury，HIRI)是臨床上肝葉切除、肝移植等手術過程中常見的并發癥。它是因術中阻斷肝門，阻止血流入肝，造成組織缺血、缺氧，血流恢復后出現的肝臟組織損傷[1]。細胞焦亡是一種與炎癥反應相關的細胞程序性死亡，分為caspase-1介導的經典焦亡通路和caspase-11介導的非經典焦亡通路[2]。近年來研究發現，肝臟缺血再灌注損傷與缺血再灌注過程中與炎癥因子caspase-1/caspase-11相關的細胞焦亡途徑被活化相關[3-4]。異氟醚是臨床常用的吸入麻醉藥，因其不經肝、腎代謝，對肝腎有保護作用而被廣泛運用于肝臟手術中，但其對肝臟缺血再灌注損傷的保護機制尚不明確。而異氟醚預處理是在缺血再灌注前給予異氟醚吸入用藥，相較于手術全程用藥有劑量小、效率高的優勢，是一種全新的給藥方式，近年來備受推崇[5]。本文旨在探究異氟醚預處理是否能對肝臟缺血再灌注損傷起保護作用，及其是否與降低介導細胞焦亡的caspase-1/caspase-11的表達相關。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 于重慶醫科大學動物實驗中心購買30只雄性C57BL/6小鼠，8～12周，體重(22±1.5)g。飼養于重慶醫科大學動物實驗中心IVC C 動物房中。自由進食、飲水，術前 12h禁食，不禁水。實驗符合重慶醫科大學實驗動物倫理保護標準及國家相關法律規定。

1.2 主要實驗器械與試劑 小動物麻醉機(中國深圳瑞沃德生命科技有限公司)，異氟醚(河北一品制藥有限公司)，HE 染色試劑盒(中杉金橋有限公司)，caspase-1 抗體(Affinity Biosciences 公司)，caspase-11抗體(Affinity Biosciences 公司)，GADPH(Abcam 公司)，HRP 抗鼠二抗(武漢博士德)。

1.3 分組及建立HIRI模型 將30只C57BL/6小鼠隨機分為3組：對照組(control組)、異氟醚組(isop組)、肝臟缺血再灌注組(HIRI組)。control組為空白對照組。HIRI 組：以乙醚麻醉小鼠，行腹部正中切口開腹，分離肝臟及周圍血管組織，以血管夾夾閉門靜脈，造成 70%肝臟缺血。缺血 30min后松開血管夾，使血流再灌注入肝，以連續縫合方式關閉腹腔。2h后以安樂死的方式處死小鼠取血液及肝臟組織作為實驗標本。isop組：術前吸入 1.4%異氟醚氣體 30min，之后間隔 30min后用乙醚麻醉小鼠后以上述方式進行 HIRI 手術并取血液及肝臟組織作為實驗標本。

1.4 肝組織HE染色及病理評分 將肝臟組織制成的石蠟切片進行HE染色后于顯微鏡下觀察，以Suzuki’s病理評分標準分別對3組小鼠肝臟組織進行評分。Suzuki’s 病理評分標準[6]：0分：無壞死、淤血及肝細胞水腫；1分：極輕微的淤血及細胞水腫(﹤10%)，偶見單個細胞壞死；2分：輕度淤血及細胞水腫(11%～30%)，輕度組織壞死(﹤30%)； 3分：中重度淤血、細胞水腫、組織壞死(31%～60%)。

1.5 生化檢查 分別收集3組小鼠血清送檢，檢查血清中丙氨酸氨基轉移酶(Alanine aminotransferase，ALT)及天冬氨酸氨基轉移酶(Aspartate aminotransferase，AST)水平。

1.6 Western Blot 分別取米粒大小的3組小鼠肝組織，用RIPA緩沖液和蛋白酶抑制劑的混合物進行裂解，BCA法測定裂解液蛋白濃度。分別取3組等量的蛋白進行12%電泳，轉移至0.45mm PVDF膜上。以5%脫脂牛奶封閉1h后，用caspase-1及caspase-11抗體覆膜，置于4℃環境培養過夜。而后37℃環境下于二抗中孵育1h。以GADPH作為對照，使用Image Lab軟件檢測印跡，分別量化各組肝組織中caspase-1及caspase-11。

1.7 統計學方法 采用 SPSS23.0 軟件對數據進行統計學分析。所有結果均以均數±標準差表示，采用方差分析法分析多組間的差異，兩組間的差異用 LSD 法分析，P< 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE染色結果 control組小鼠肝臟組織鏡下可見無淤血、組織壞死及細胞水腫等病理變化，而HIRI組小鼠肝組織中可見匯管區大量細胞水腫、炎性細胞聚集及細胞壞死，HIRI組Suzuki’s評分明顯高于control組(P<0.05)；而isop組肝組織中偶見細胞壞死及炎性細胞聚集，細胞水腫則較HIRI組明顯減輕，各組Suzuki’s評分分別為control組(1.1±0.99)分，isop組(3.4±0.84)分，HIRI組(6.2±1.03)分，isop組較HIRI組顯著降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組小鼠肝臟 HE 染色切片(×100)

2.2 ALT/AST結果 收集并檢測各組小鼠血清中ALT及AST水平得出：HIRI組小鼠血清中ALT及AST水平均較control組顯著增高(P均<0.05)，而isop組小鼠血清中ALT及AST水平均較HIRI組顯著降低(P均<0.05)。見表1。

2.3 Western Blot結果 用Western Blot分別檢測各組小鼠肝組織中caspase-1及caspase-11的表達，結果得出HIRI組小鼠肝臟中caspase-1及caspase-11的表達均顯著高于control組(P均<0.05)，而isop組中caspase-1及caspase-11的表達則較HIRI組顯著降低(P均<0.05)。見圖2、表2。

表1 各組血清ALT/AST結果

圖2 Western Blot檢測肝組織中caspase-1/caspase-11的表達

表2 各組caspase-1和caspase-11的相對表達量

3 討論

肝臟缺血再灌注損傷是因肝組織在缺血缺氧環境下血液對組織的供能停止，而活性氧等機體有害代謝產物蓄積，對肝組織及供能造成損傷。當恢復血供時，不但不能改善這一情況，反而會因一系列炎癥反應的活化，加重肝臟組織及功能的損害[7]。評價吸入麻醉藥的效價強度時常用最低肺泡有效濃度(Mininum alveolar concentration，MAC)藥物濃度，因此實驗中筆者選用1.4%這一異氟醚的最低肺泡有效濃度，探究其在肝臟缺血再灌注損傷過程中，異氟醚預處理對肝臟缺血再灌注損傷的保護作用及其機制。

焦亡作為一種與炎癥反應相關的細胞程序性死亡，近年來廣泛研究其發生與缺血再灌注損傷的關系，以期能通過干預細胞焦亡的相關通路的活化而使器官缺血再灌注損傷得以改善[8]。細胞焦亡的途徑分為caspase-1介導的經典焦亡途徑和caspase-11介導的非經典焦亡途徑[9]。實驗證明，多種臟器的缺血再灌注過程中，由于活性氧蓄積、細胞內鈣超載等因素都可以活化caspase-1介導的細胞焦亡經典途徑，促進焦亡的發生，導致臟器的缺血再灌注損傷。而caspase-11介導的細胞焦亡非經典途徑則與感染相關[10-11]。在膿毒血癥的模型中研究發現，革蘭陰性菌表面脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)能以胞吞的形式進入細胞，胞內的未活化的caspase-11是LPS天然的受體，LPS入胞后與其結合并活化caspase-11，啟動了細胞焦亡非經典途徑，促使下游IL-1β、IL-18等炎癥因子釋放，導致組織及功能受損[12]。因阻斷肝門時會造成腸系膜靜脈淤血，腸道內革蘭陰性菌入血，再灌注時，革蘭陰性菌隨血流入肝，釋放表面LPS進入肝臟固有巨噬細胞——Kupffer細胞，活化細胞內caspase-11，啟動肝臟的細胞焦亡非經典途徑，對肝臟造成損害[13]。而因此，筆者選擇caspase-1和caspase-11為靶點進行研究。

本實驗由肝臟組織切片HE染色觀察并進行病理評分后得出：HIRI組小鼠病理評分明顯高于control組(P<0.05)，而經異氟醚預處理后的isop組小鼠病理評分較HIRI組小鼠顯著降低(P<0.05)。與此同時，血清ALT/AST的檢測結果也得出同樣的結果。由此可得出結論：異氟醚預處理能減輕小鼠肝臟缺血再灌注損傷，并對肝功能起到一定的保護作用。而后，經Western Blot對各組小鼠肝臟組織中caspase-1/caspase-11表達情況的檢驗得出：HIRI組小鼠肝臟組織中caspase-1/caspase-11表達明顯高于control組(P均﹤0.05)，而isop組小鼠肝臟組織中caspase-1/caspase-11表達則較HIRI組明顯降低(P均﹤0.05)，由此可得：肝臟缺血再灌注損傷與caspase-1和caspase-11介導的細胞焦亡途徑被活化有關，而異氟醚預處理對小鼠肝臟缺血再灌注損傷起保護作用，并且這一作用與其對caspase-1/caspase-11表達起到的抑制作用有關。因此筆者得出結論：異氟醚預處理對肝臟缺血再灌注損傷有保護作用，并且這一作用可能與通過抑制細胞焦亡相關蛋白caspase-1及caspase-11的表達，一定程度抑制細胞焦亡途徑的活化相關，但具體機制尚不明確，有待進一步研究。