纈沙坦對主動脈球囊損傷大鼠主動脈內膜SRSF1表達的影響

彭亮 段碩 李永紅 徐輝 楊茜 唐錫龍

(1 青島大學醫學院附屬醫院心內科，山東 青島 266003； 2 平邑縣人民醫院急診科； 3 武漢亞洲心臟病醫院心內科)

血管平滑肌細胞(VSMCs)增殖是血管內膜增生的關鍵，內膜增生是一種普遍而嚴重的病理過程，可導致動脈硬化、血管成形術后再狹窄等[1]。當血管發生損傷時，VSMCs遷移到內膜，開始增殖并分泌細胞外基質，導致動脈內膜擴張，即新生內膜形成，從而進一步導致嚴重的心血管疾病，如高血壓、缺血性疾病等[2]。研究發現纈沙坦在降低血壓的同時，還能抑制血管平滑肌細胞的遷移與增殖，減輕血管內皮損傷后內膜的增生，降低術后血管再狹窄的發生[3-5]。絲氨酸/精氨酸富集剪接因子1(SRSF1)是選擇性剪接因子家族的典型成員之一,其在調控mRNA代謝、維持基因組穩定性、調控細胞活力以及調節細胞周期進展方面發揮著關鍵的作用[6-9]。但SRSF1在血管系統中具體的作用機制尚不清楚。最近有研究發現SRSF1在調節內皮細胞衰老及促進血管平滑肌細胞增殖方面發揮重要作用[9-11]。本研究通過觀察纈沙坦治療前后球囊損傷模型中大鼠主動脈血管內膜SRSF1的表達情況，探討纈沙坦對血管內皮損傷后再狹窄的作用及其機制，為臨床治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗分組與處理

取健康雄性Wistar大鼠48只，體質量為250～300 g，購買于青島大學醫學部實驗動物中心。隨機分為對照組、手術組和纈沙坦組，每組各16只大鼠。適應性飼養2周后，從術前1 d至術后14 d(或28 d)，手術組和對照組大鼠每天分別給予5 mL蒸餾水灌胃，纈沙坦組大鼠每天將20 mg/kg纈沙坦溶于5 mL蒸餾水中進行灌胃。大鼠稱體質量后以3 g/L的戊巴比妥鈉(20 mg/kg體質量)腹腔注射麻醉，取頸部正中切口切開皮膚，仔細分離血管后，使用注射器經頸總靜脈給予100 U/kg低分子肝素鈉抗凝。手術組和纈沙坦組大鼠均行主動脈球囊損傷術，操作方法如下：將自制的2F球囊導管自大鼠的左頸總動脈緩慢插入至腹主動脈下端，以0.08～0.10 mL無菌氯化鈉鹽水充盈球囊，將導管向不同方向抽拉3次，使主動脈內膜充分剝脫；對照組大鼠操作與手術組相同，但未注水充盈擴張球囊。所有大鼠手術完成后，縫合并且消毒切口，然后肌注200 000 U青霉素預防感染。各組分別于術后第14天和第28天處死各8只大鼠，收集近主動脈弓血管5 mm，以40 g/L多聚甲醛溶液固定后備用。

1.2 大鼠主動脈血管內膜增生的檢測

將固定好的血管以石蠟包埋并5 μm厚切片，經蘇木精-伊紅(HE)染色后，普通光學顯微鏡下觀察血管內膜增生情況，使用Simple PCI圖像分析系統檢測內膜厚度。

1.3 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測血管組織中SRSF1 mRNA表達情況

使用Trizol試劑盒(Invitrogen公司，美國)從血管組織中提取總RNA，逆轉錄合成cDNA。引物由上海生工生物工程有限公司設計并合成，SRSF1上游引物序列：5′-CACTGGTGTCGTGGAGTTTGTACGG-3′，下游引物序列：5′-GGGCAGGAATC-CACTCCTATG-3′，擴增片段長為126 bp。內參β-actin上游引物序列：5′-CCTAGACGTCGATCAA-GAGA-3′，下游引物序列：5′-GGAACGAAGGCT-CGAAGA-3′，擴增片段長為126 bp。使用PCR儀進行擴增，以2-△△CT方法比較樣本基因表達差異。

1.4 免疫熒光法檢測血管組織中SRSF1蛋白表達

將血管標本石蠟切片經二甲苯、梯度乙醇水化、脫蠟后，在乙二胺四乙酸溶液中煮沸進行抗原修復。滴加兔抗SRSF1(1∶80)一抗(Thermo Fisher公司，美國)，將載玻片放入濕盒內4 ℃下孵育過夜。PBS洗滌3次，每次5 min。滴加二抗，室溫下避光孵育50 min。PBS洗滌后，用DAPI溶液對細胞核染色5 min，PBS洗滌3次后，滴加防萃滅劑，封片。將切片置于徠卡倒置熒光顯微鏡下進行觀察并采集圖像。

1.5 統計學分析

2 結 果

2.1 各組大鼠血管組織的形態學比較

對照組大鼠主動脈球囊損傷術后第14天和第28天時主動脈內膜光滑，均無明顯損傷及斑塊形成，而手術組和纈沙坦組血管內均可見新生內膜增生，創面均有不同程度的內皮細胞覆蓋，內彈力膜部分斷裂(圖1A～F)。手術后第14天，對照組、手術組以及纈沙坦組血管內膜的厚度分別為(23.70±8.64)、(88.31±8.07)、(74.59±8.12)μm。術后第28天的內膜厚度分別為(25.47±8.34)、(117.04±8.23)、(80.65±8.14)μm。重復測量設計的方差分析結果顯示，組別、時間、時間與組別(交互作用)對大鼠主動脈血管內膜的厚度均有顯著影響(F組別=372.90，F時間=26.13，F交互=12.31，P<0.05)；與對照組相比，術后第14、28天手術組與纈沙坦組內膜厚度均明顯增加，纈沙坦組內膜厚度較手術組明顯降低(F=176.43、241.08，P<0.05)。

2.2 各組血管組織中SRSF1 mRNA表達情況

RT-qPCR檢測結果顯示，術后第14天，對照組、手術組、纈沙坦組血管內膜SRSF1 mRNA相對表達量分別為(0.24±0.17)、(1.17±0.15)、(0.72±0.13)。術后第28天SRSF1 mRNA的相對表達量分別為0.27±0.12、1.52±0.19、0.98±0.19。重復測量設計的方差分析結果顯示，組別、時間以及時間與組別(交互作用)對大鼠主動脈血管內膜SRSF1 mRNA相對表達量具有顯著影響(F組別=184.60，F時間=21.15，F交互=4.22，P<0.05)。單獨效應結果顯示，術后第14、28天，手術組、纈沙坦組血管內膜SRSF1 mRNA的相對表達量較對照組明顯升高，纈沙坦組SRSF1 mRNA的相對表達量較手術組明顯降低，差異有統計學意義(F=23.18、32.71，P<0.05)。

2.3 各組血管組織中SRSF1蛋白的表達情況

免疫熒光檢測結果顯示，術后第14、28天對照組大鼠血管組織中SRSF1蛋白熒光強度極低，手術組和纈沙坦組熒光強度顯著高于對照組，纈沙坦組熒光強度明顯低于手術組。與術后第14天相比，術后第28天手術組、纈沙坦組血管組織中SRSF1蛋白熒光強度均明顯增加，見圖2A～2F。

A～C分別為對照組、手術組、纈沙坦組術后第14天內膜增生情況；D～F分別為對照組、手術組、纈沙坦組術后第28天內膜增生情況，HE染色，200倍

A～C分別為對照組、手術組、纈沙坦組術后第14天血管組織中SRSF1蛋白的表達情況；D～F分別為對照組、手術組、纈沙坦組術后第28天血管組織中SRSF1蛋白的表達情況，免疫熒光染色，200倍

3 討 論

在經皮冠狀動脈介入治療(PCI)過程中，球囊擴張與支架展開時對血管壁造成的機械性損傷，一直是引起術后血管再狹窄的重要因素，嚴重影響患者預后[12]。因此，有效地預防血管再狹窄的發生，可進一步提高PCI的治療效果。研究表明，PCI術后再狹窄的發生可能與血管彈性回縮、炎癥反應及VSMCs過度增殖等有關[13]。

在正常情況下，VSMCs在動脈血管中膜中是維持非增殖狀態的[14]。當受到損傷或其他刺激時，VSMCs遷移到內膜，開始增殖并分泌細胞外基質，促進新內膜的形成，可能是導致PCI術后嚴重心血管系統并發癥，如高血壓、缺血性疾病以及后續的心肌梗死、中風和充血性心力衰竭等的主要原因[15]。VSMCs異常增殖與動脈粥樣硬化和損傷后新內膜形成導致的再狹窄密切相關[16-17]。本研究中，球囊損傷主動脈內皮后手術組及纈沙坦組以術后第14、28天血管內均可見新生內膜增生，創面均有不同程度的內皮細胞覆蓋，內彈力膜部分斷裂，血管內膜較對照組明顯增厚，說明血管損傷后由于血管內膜增生形成了血管再狹窄。與術后第14天相比，手術組術后第28天血管內膜的增生程度進一步加重，提示血管損傷后再狹窄的程度會隨著時間的推移進一步加重。而使用纈沙坦藥物干預后，術后第14、28天的血管內膜增生程度均明顯小于未使用藥物干預的手術組，血管內皮的增生程度變輕。提示纈沙坦可有效減輕血管內膜損傷后內膜的增生情況。

SRSF1參與多種病理過程，包括病毒感染和腫瘤的發生、發展等過程[18-20]。有研究表明，SRSF1的上調可促進動脈損傷時VSMCs的增殖響應或促進有絲分裂刺激新內膜形成，而SRSF1的缺失則減弱了血管損傷或者有絲分裂刺激的反應[20-24]。XIE等[11]研究顯示，SRSF1通過Δ133p53/EGR1/KLF5路徑促進VSMCs的增殖。由于增強的VSMCs增殖與許多血管增生性疾病的發病有關，因此應該對包括動脈粥樣硬化、支架內冠狀動脈再狹窄等疾病采取抗增殖治療[25-26]。本研究中，手術組及纈沙坦組血管組織中SRSF1 mRNA相對表達量較對照組均明顯升高，但纈沙坦組SRSF1 mRNA表達量較手術組降低，本研究結果也驗證了上述觀點。

纈沙坦作為血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)的代表藥物，除了具有降壓作用外，還可以通過抑制VSMCs的遷移及增殖，減輕血管內膜損傷后內膜的增生，降低術后再狹窄的發生[27-30]。本研究中，手術組血管內膜厚度明顯高于纈沙坦組，說明血管內膜損傷后SRSF1的mRNA及蛋白均是高表達，經纈沙坦治療后，損傷的血管組織中SRSF1 mRNA以及蛋白表達水平較治療前均明顯降低，內膜增厚程度明顯受限，說明SRSF1 mRNA以及蛋白在調節VSMCs增殖及其在新內膜增生的發病機制中發揮重要作用。

由此可以推斷SRSF1可能通過促進VSMCs的遷移和增殖，進一步促進血管損傷后內膜增厚。SRSF1在增生的血管內皮及平滑肌細胞中表達增加，可能與其促進平滑肌細胞增殖和新生內膜增厚有關。SRSF1表達的變化是否與纈沙坦的作用直接相關，目前仍未知。總之，纈沙坦可有效減輕內膜損傷血管的內膜增生程度，其作用機制可能與其下調血管組織中SRSF1 mRNA及蛋白的表達有關。