雪膽素甲對胃癌細胞SGC-7901增殖和侵襲能力的影響

曹淑君 初向華 李宗莉 張翠萍 孫向紅

(青島大學附屬醫院，山東 青島 266003 1 藥劑科； 2 消化內科)

雪膽素甲(CuⅡa)是雪膽屬植物的主要活性成分，近年來研究顯示，CuⅡa通過誘導細胞凋亡、抗血管生成及氧化應激等途徑發揮抗腫瘤作用，可作為新型的潛在抗癌藥物[1-3]。如CuⅡa通過不可逆的促進肌動蛋白的聚集及抑制凋亡抑制基因survivin的表達，從而抑制癌細胞的增殖[1]。CuⅡa 能明顯抑制人肺癌細胞系NCI-H460和A549增殖并誘導其凋亡，其機制可能與抑制AuroraA、STAT3及Cofilin等多種信號通路有關[4]。然而，Wnt/β-catenin信號的調節與腫瘤細胞代謝高度相關，其激活可導致多種腫瘤細胞的化療抗性[5-6]。因此，靶向Wnt/β-catenin信號通路的治療能有效抑制腫瘤生長[7]。研究顯示，在Wnt/β-catenin信號通路中，糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)的激活可導致β-連環蛋白(β-catenin)降解障礙，β-catenin進入細胞核內，與核內轉錄因子TCF/LEF形成復合體，進一步使得細胞周期素D1(CyclinD1)、C-myc等靶基因激活，導致細胞周期的調控異常，從而引起腫瘤的發生發展[8-9]。CuⅡa對胃癌Wnt/β-catenin信號通路的調節作用尚少見報道，本研究旨在探討CuⅡa對胃癌SGC-7901細胞增殖和遷移能力的影響及其分子作用機制，以期為胃癌的臨床治療開辟新的途徑。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

人胃癌SGC-7901細胞購自中國科學院上海細胞所。CuⅡa購自中國藥品生物制品檢定所；胎牛血清(FBS)、RIP細胞裂解液、PVDF膜和ECL化學發光試劑購自Millipore公司(美國)；RPMI1640培養基及雙抗(青霉素和硫酸鏈霉素)購自Hyclone(美國)；CCK-8 試劑盒、凋亡檢測試劑盒購自DoJindo公司(日本)；β-catenin、CyclinD1、GSK-3β和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗購自Cell Signaling公司(美國)；兔抗人C-myc購買自Abcam 公司(英國)；兔抗人GAPDH購買自伊萊瑞特生物科技股份有限公司；CuⅡa以DMSO溶解成濃度為20 mmol/L，凍存于-20 ℃，使用時以無血清的RPMI1640培養基將CuⅡa稀釋成0.01、0.1、1、10、100 μmol/L的濃度。

1.2 細胞培養

將人胃癌SGC-7901細胞置于含體積分數為0.10胎牛血清的RPMI1640培養基，于37 ℃、含體積分數為0.05 CO2的細胞培養箱中進行無菌培養，每2～3 d傳代1次，細胞達到對數生長期后用于后續實驗。

1.3 以CCK-8法檢測細胞增殖抑制率

取對數生長期的SGC-7901細胞，以5×103/孔的密度接種于96孔板中，細胞貼壁后，分別加入0、0.01、0.1、1、10、100 μmol/L的CuⅡa溶液(A、B、C、D、E、F組)孵育48 h后，每孔加入10 μL CCK-8于37 ℃孵育4 h，用酶標儀測定450 nm波長處的吸光度值，每個樣本設置4個復孔。試驗重復3次，取均值。

1.4 以Transwell小室檢測細胞遷移能力

以0、0.01、0.1、1、10、100 μmol/L的CuⅡa溶液(A、B、C、D、E、F組)作用SGC-7901細胞48 h后，上室加入含有20×105個SGC-7901細胞的懸浮液，下室加入600 μL的無血清培養基作用24 h，移去下室培養基，以甲醇固定15 min后，加入含體積分數為0.001結晶紫溶液染色10 min。以PBS清洗后用棉簽擦去上室上面的細胞，風干后在顯微鏡下取3個視野，照相，計算穿膜細胞數。

1.5 以流式細胞儀檢測細胞凋亡能力

以0、0.01、0.1、1、10、100 μmol/L的CuⅡa 溶液(A、B、C、D、E、F組)作用SGC-7901細胞48 h以后，用預冷的PBS洗滌2次，加入5 μL AnnexinV-FITC 和5 μL PI solution，輕輕混勻，室溫下避光孵育15 min后，加入1×Annexin V Binding Solution 400 μL，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.6 以蛋白免疫印跡法(Western blot方法)檢測β-catenin、GSK-3β、C-myc和CyclinD1蛋白表達

以0、0.01、0.1、1、10、100 μmol/L的CuⅡa溶液(A、B、C、D、E、F組)處理SGC-7901細胞48 h后，用RIPA裂解液裂解細胞后離心，取上清液，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。在SDS-PAGE凝膠中，每個泳道加入30 μg的蛋白樣品，80 V 30 min及110 V 1 h電泳分離蛋白，電轉至PVDF膜上，以50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h，然后將條帶分別加入β-catenin、GSK-3β、C-myc和CyclinD1一抗液中，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次15 min，二抗37 ℃下孵育1 h，TBST洗膜3次，每次15 min，ECL顯影。以Image J軟件分析目的蛋白條帶與GAPDH灰度比值，計算相對表達量。

1.7 統計學分析

2 結 果

2.1 CuⅡa對胃癌細胞增殖的影響

CuⅡa作用SGC-7901細胞48 h后，A、B、C、D、E及F組細胞增殖抑制率分別為0、5.54±0.59、12.37±2.20、21.73±2.07、35.60±1.41、48.13±5.49，組間比較差異具有顯著意義(F=98.346，P<0.05)；B、C、D、E、F組細胞增殖抑制率與A組比較，差異有顯著性(P<0.05)。

2.2 CuⅡa對SGC-7901細胞遷移的影響

CuⅡa作用SGC-7901細胞48 h后，A、B、C、D、E、F組遷移細胞數分別為168.16±13.06、144.26±8.19、125.36±10.09、103.63±7.18、79.09±4.24、46.15±11.06、48.13±5.49，組間比較差異有顯著意義(F=44.662，P<0.05)；C、D、E、F組遷移細胞數與A組比較，差異有顯著意義(t=3.652～10.243，P<0.05)；B組遷移細胞數與A組比較，差異無顯著意義(P>0.05)。見圖1。

A、B、C、D、E、F分別為A、B、C、D、E、F組

2.3 各組細胞凋亡水平比較

CuⅡa作用SGC-7901細胞48 h后，A、B、C、D、E及F組細胞的凋亡率分別為(10.18±0.98)%、(12.59±0.95)%、(16.34±0.74)%、(18.32±1.24)%、(32.49±0.74)%、(57.68±1.42)%，組間比較差異有顯著統計學意義(F=15.812，P<0.05)；C、D、E、F組細胞的凋亡率與A組比較，差異具有顯著統計學意義(t=7.078～38.926，P<0.05)；B組細胞凋亡率與A組比較，差異無顯著的統計學意義(P>0.05)。見圖2。

2.4 CuⅡa對于SGC-7901細胞β-catenin、C-myc、CyclinD1和GSK-3β蛋白表達的影響

CuⅡa作用SGC-7901細胞48 h后，在A、B、C、D、E、F組中β-catenin、C-myc、CyclinD1和GSK-3β蛋白表達量比較差異均具有顯著性(F=8.494～21.763，P<0.05)；C、D、E、F組β-catenin、C-myc、CyclinD1和GSK-3β的蛋白表達量與A組比較，差異均有顯著性(t=2.889～7.868，P<0.05)；而B組β-catenin、C-myc、CyclinD1和GSK-3β蛋白表達量相與A組比較，差異無顯著意義(P>0.05)。見圖3、表1。

3 討 論

胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，腫瘤細胞的侵襲和轉移是導致復發的主要原因[10]。特別是在中國，胃癌高居惡性腫瘤發病率的第二位，死亡率高達36%[11]。胃癌患者的臨床治療包括手術及化療和放療等輔助治療[12]。但總體治療效果有限，因此胃癌的治療仍面臨重大的挑戰[13-14]。

研究顯示，中藥對腫瘤有一定的抑制作用，具有副作用小、價格便宜等優點，易于被患者接受[15-16]。在醫療實踐中，中醫藥被廣泛應用于各種疾病的治療中[17-19]。CuⅡa是中藥雪膽的主要成分，毒性低，具有抗炎、抗腫瘤等作用[20-21]。研究發現CuⅡa可抑制肺腺癌細胞的黏附和遷移，從而促進腫瘤細胞凋亡[4]。本研究通過觀察CuⅡa處理后胃癌細胞SGC-7901增殖、凋亡、侵襲和遷移情況的變化，探討CuⅡa是否具有抗胃癌的作用。結果顯示，CuⅡa處理后的C、D和E組細胞活力和遷移穿膜細胞數量均低于A組，但細胞總凋亡率均高于A組，提示CuⅡa具有抑制胃癌細胞SGC-7901增殖、侵襲和遷移并促進其凋亡的作用。

A、B、C、D、E、F分別為A、B、C、D、E、F組

A、B、C、D、E、F分別為A、B、C、D、E、F組

表1 CuⅡa對SGC-7901細胞Wnt/β-catenin信號通路蛋白表達的影響

Wnt/β-catenin是一個經典的信號通路，對人類腫瘤的發生、發展和預后有重要意義[22-23]。研究發現β-catenin有多種功能，可通過Wnt/β-catenin途徑發揮重要的作用，也是整條通路的關鍵樞紐分子[24-25]。當Wnt/β-catenin在腫瘤細胞中處于激活狀態時，Wnt配體與細胞膜上的卷曲蛋白(Frizzled)相關蛋白結合以后，在低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP)作用下，激活細胞內的蓬亂蛋白(Dvl)使GSK-3β發生磷酸化并抑制其活性，導致β-catenin與Ecadherin、APC、Axin、GSK-3β等復合物解離，進而使得β-catenin去磷酸化，并轉移到細胞核與TCF/LEF形成復合物，誘導其下游靶基因C-myc、CyclinD1激活，通過調控細胞分化和生長來調控細胞周期[26-27]。反之，當Wnt受體沒有與Wnt配體結合時，細胞內β-catenin降解復合物形成，促進了β-catenin的降解，抑制了Wnt信號的轉導[6,28]。因此，β-catenin目前已經成為治療腫瘤重要靶點之一，因此抑制該通路的活化為腫瘤的治療提供了新的可行性。

為進一步探討CuⅡa對Wnt/β-catenin信號轉導作用，本研究檢測了β-catenin、C-myc、CyclinD1以及GSK-3β蛋白的表達情況。Western blot檢測結果顯示，CuⅡa作用SGC-7901細胞48 h后，細胞中β-catenin、C-myc和CyclinD1蛋白水平均顯著下調，GSK-3β蛋白的表達顯著上調。但B組細胞β-catenin、GSK-3β、C-myc和CyclinD1蛋白表達與A組比較無明顯的統計學差異，這可能與劑量不夠，達不到抑制蛋白表達的作用有關。本研究結果表明，在Wnt/β-catenin信號通路中，CuⅡa可能是通過激活GSK-3β的表達導致β-catenin復合物無法形成而抑制β-catenin蛋白，進而抑制C-myc和CyclinD1的蛋白表達，從而抑制胃癌細胞增殖和遷移。

綜上所述，CuⅡa抑制胃癌發生的機制可能與抑制Wnt/β-catenin通路激活有關，進而抑制胃癌細胞的增殖及其遷移能力。因此，CuⅡa可能是胃癌治療的潛在抗癌藥物，其抑制Wnt/β-catenin信號通路和隨后下調Wnt靶基因的表達可能是抑制胃癌發生的分子機制。其抗腫瘤效應機制為該重要天然產物后續研究提供了理論依據。