基因編輯技術CRISPR/dCas9靶向去甲基化的研究與應用進展

楊 煒 圻

（河西學院醫學院，甘肅 張掖 734000）

表觀遺傳學是研究基因序列不發生改變的情況下，通過DNA甲基化、組蛋白修飾和空間結構域的改變調節控制基因表達的的一門遺傳學的分支學科.在哺乳動物基因組中，大約70%的胞嘧啶殘基在5’-CpG-3’都被甲基化，DNA甲基化操控著許多生物進程，現已證明DNA甲基化與許多疾病有關，包括腫瘤、印記疾病［1］.

DNA 甲基化是在DNA 甲基轉移酶的作用下，利用S-腺苷甲硫氨酸提供甲基，在CpG二核苷酸中胞嘧啶嘧啶環的五號碳原子上加上甲基的共價修飾過程.TET 蛋白家族能轉化5-甲基胞嘧啶為5-羥甲基胞嘧啶，從而啟動去甲基化的過程［2］.DNA甲基化能關閉某些基因的活性，去甲基化則可誘導基因的重新活化和表達.盡管DNA 甲基化在許多生物進程中起重要作用，但由于缺乏廣泛可行的技術在特定的靶點添加或移除甲基化，其在許多疾病中的致病影響并不清楚. 在原理上，基因編輯技術可以應用在靶向表觀遺傳學治療，但沒有特異性的方法能移除甲基化.像5-aza-2’脫氧胞苷能抑制DNA甲基化轉移酶，常被用來研究甲基化的轉錄起始點［3］.然而5-aza-2’脫氧胞苷是作用于整個基因組的去甲基化，很難針對特定的DNA甲基化區域進行去甲基化，如果使用其進行治療性的應用會面對很多無法預料的問題.

近年來，CRISPR/Cas9［4-6］這種基因編輯技術可以通過融合非催化活性核酸內切酶來補充特異位點的催化活性. CRISPR/ dCas9 系統應用dCas9能與DNA序列結合的能力，使其發揮轉錄因子的作用，融合TET 結構蛋白家族在細胞中能羥化特定的位點，可以激活去甲基化.這樣看來，CRIS?PR/ dCas9 技術的出現為DNA 靶向去甲基化提供了條件.

1 CRISPR/dCas9系統的作用機制

CRISPR/Cas9 是對靶向基因進行特定DNA 修飾的重要工具，其具有效率高、操作簡單的特點. CRISPR/Cas9 系統可以特異性的識別出外源DNA，并將它們切斷，沉默外源基因的表達.CRISPR/Cas9 系統是細菌針對噬菌體和質粒DNA入侵進化形成的一種獲得性免疫系統.大約40%的細菌和90%的古細菌擁有CRISPR/Cas 位點［7-9］.CRISPR/Cas 系統按照其結構特點可以分為3 大類型（I 型、II 型和III 型系統），它們的共同特點是RNA介導的核酸酶能夠特異性地切割外源入侵的DNA，包括噬菌體和質粒DNA［5］.II型CRISPR/Cas系統鑒于其結構簡單，目前被廣泛應用于真核細胞的基因組編輯中.CRISPR位點由一系列短的重復序列（Repeats）構成，這些重復序列被具有相同長度的“間隔序列”隔開.間隔序列可與噬菌體基因組配對結合并使入侵細菌和古細菌的外源遺傳物質降解. 當外源噬菌體或質粒入侵宿主菌時，“重復—間隔”陣列被轉錄成長的crRNA 前體.crRNA 前體可被CRISPR-associate（Cas）核酸酶或者細菌內源RNA 酶III 在重復序列處切割，并釋放出小的crRNA. 然后crRNA 與輔助小片段RNA（Trans-activatingcrRNA，tracrRNA）通過部分序列互補形成RNA 二聚體，該二聚體能夠被Cas9 蛋白特異識別并形成RNA蛋白復合體，通過crRNA序列中的間隔序列介導Cas9核酸酶發現靶序列并降解侵入物的基因組. 在自然狀態下，Cas9 由tracrRNA 和crRNA 前體介導至其靶點，在人工合成的系統中這2個短的RNA 可以被融合成一個嵌合的導向RNA（guideRNA）［10，11］.CRISPR/Cas9系統由單鏈的guideRNA 和有核酸內切酶活性的Cas9蛋白構成，能特異性識別靶基因序列，并在靶定位點剪切雙鏈DNA，細胞的非同源末端連接修復機制重新連接斷裂處的基因組，并引入插入或缺失突變，也可提供一個外源雙鏈供體DNA片段通過同源重組整合進斷裂處的基因組，從而達到對DNA修飾的目的［5，6］.CRISPR/Cas9系統能在293T、K562、iPS等多種細胞中，進行有效的靶向酶切，非同源重組、同源重組效率在3%～25%之間，并能在多個靶點進行靶向酶切.

Cas9 的核酸酶剪切活性取決于兩個結構域：RuvC和HNH.這兩個結構域分別負責切割DNA的兩條鏈，并且這兩個結構域能夠單獨地被人工點突變失活.化膿性鏈球菌中存在一種Cas9D10A突變體，這種鏈球菌Cas9 的RuvC 失活（RuvC-），HNH 仍有活性（HNH+）；另一種Cas9H840A 的突變體的Cas9 蛋白則呈現RuvC 激活（RuvC+）和HNH 失活（HNH-）的狀態，但這兩種突變體的Cas9仍然具有核酸酶活性，可對靶向序列進行剪切作用. 當RuvC 和HNH 同時處于失活狀態時（D10A&H840A；RuvC-&HNH-），Cas9 將不具有核酸酶活性，成為dCas9（deadCas9）［12，13］.dCas9與靶向特定基因gRNA在細胞中共表達，則gRNA可以介導dCas9蛋白與DNA結合.如果dCas9結合到靶基因的閱讀框內，可以阻斷RNA聚合酶的延伸作用，如果dCas9 結合到靶基因的啟動子區域，則可以阻止基因轉錄的起始.研究者利用dCas9與DNA 序列結合的能力，將dCas9 與其他蛋白的融合，使其發揮轉錄因子的作用，促進或抑制基因的表達.

2 CRISPR/dCas9系統靶向去甲基化的研究

DNA去甲基化催化酶在表觀遺傳調控中很重要，但尚不清楚這些胞嘧啶修飾如何被逆轉.TET1 是一種α-酮戊二酸和Fe2+依賴的雙加氧酶，催化5-甲基胞嘧啶（5mC）轉化為5-羥甲基胞嘧啶（5hmC），還可以從5mC以酶促活性依賴性的方式生成5-甲酰基胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC）［14］.He 等［15］研究表明，TET1 雙加氧酶將DNA 中的5mC 和5hmC 氧化為5caC 后，被修飾的5caC 被胸腺嘧啶-DNA 糖基化酶（TDG）特異性識別和切除，再通過堿基切除修復途徑使該位點轉化為胞嘧啶，構成了活性DNA去甲基化的途徑.

來自中科院上海生化細胞所的胡榮貴研究員課題組的研究員Xu等［16］用dCas9和gRNAs插入雙拷貝的噬菌體MS2RNA 元件，構建了修改的單導向RNAs（sgRNAs）（sgRNA2.0），從而有利于TET1催化結構域（TET1-CD）與dCas9 或MS2 外殼蛋白融合，進而結合到特定基因位點行駛DNA去甲基化功能. 這個系統能顯著上調的轉錄目標基因，并且dCas9/sgRNA2.0-directed 去甲基化能高效針對目標基因，其脫靶率低.

日本科學家SumiyoMorita 等［17］更完整的應用dCas9融合TET1進行靶向去甲基化.失去剪切活性的dCas9融合具有催化活性的TET1（TET1CD），羥化特異性的位點以激活該位點的去甲基化.另外，加入SunTag補充TET1-CD，可以使TET1-CD的活性明顯改善［17］. SunTag 實質上是一套分子掛鉤，其能夠將多個拷貝的生物活性分子掛到可用來靶向一些基因或其他的分子的蛋白質支架上.相比于沒有這些掛鉤的組裝分子，整合了SunTag的分子生物活性顯著放大［18，19］.多重復拷貝的TET1 羥化酶和dCas9的融合極大地增強去甲基化的活性.SumiyoMorita 等還證明，dCas9 融合TET1 的系統適用于在胚胎干細胞，癌細胞系，原代神經前體細胞和小鼠胎兒體內的操縱特定位點的甲基化，使體內治療表觀疾病成為可能.

Liu等［20］早期研究表明，dCas9和TET1或DN?MT3a融合可以精確編輯CpG甲基化區域，可以使甲基化或去甲基化啟動子序列激活或者沉默，無論在體外還是體內.腦源性神經營養因子Ⅳ（BDNFⅣ）或肌分化轉錄激活因子MyoD的靶向去甲基化作用可以通過融合dCas9-TET1 加強，從而誘導BDNF在有絲分裂后的神經元中表達或激活MyoD促進成纖維細胞重編程為成肌細胞.新創靶向重新甲基化的CTCF環的位點，通過dCas9-DNMT3a融合蛋白阻斷基因編碼的轉錄因子CTCF 綁定和干擾DNA 循環，導致鄰近基因環的表達改變.他們再一次證實了dCas9 可以在體內應用于DNA 甲基化.

3 CRISPR/dCas9系統靶向去甲基化的應用

CRISPR/dCas9系統靶向去甲基化中的研究結果表明，TET1、DNMT3a 和dCas9 融合，代表了一個強大的能夠編輯特定基因序列的DNA甲基化工具箱.Vojta等［21］研究表明，dCas9融合DNMT3a可用于兩個人類基因啟動子，Xu 等［16］和Choud?hury 等［22］人研究表明，dCas9 融合TET1 可用于基因啟動子去甲基化.應用CRISPR/dCas9 系統可以使甲基化的編輯比以往更精準高效.

Liu 等［23］利用其研究的DNA 甲基化編輯工具來逆轉超甲基化事件，證明了可以通過CRISPR介導的FMR1 基因的DNA 甲基化編輯來治療脆性X 綜合征（FXS）.脆性X 綜合征（FXS）是男性最常見的智力殘疾遺傳形式，是由于FXS患者FMR1基因的沉默與FMR1的5’UTR中CGG擴展突變的超甲基化有關［24］. 該研究設計了一個單一的sgRNA，以指導dCas9-TET1有效地使病理FMR1基因座中的CGG 重復序列脫甲基.CGG 擴展完全的去甲基化會導致CpG 島的甲基化不足，在FMR1 啟動子處增加H3K27 乙酰化和H3K4 三甲基化，減少H3K9三甲基化，并解鎖FMR1基因的表觀遺傳沉默，從而恢復FXSiPSC和神經元中的FMRP表達，且無明顯關閉定位效果.FMR1的表達噬菌體蛋白AcrIIA4 抑制dCas9-TET1 后，在編輯過的FXS 細胞中其啟動子的去甲基化作用恢復了突變神經元的野生型表型.并且在移植到小鼠腦部后，體內的編輯神經元中FMR1的重新激活得以維持.研究還證明有絲分裂后FXS神經元中CGG重復的去甲基化會重新激活FMR1，并逆轉與FXS 神經元相關的自發性過度活躍，即通過表觀基因組編輯逆轉基因失活可能是涉及表觀遺傳沉默的疾病的有效治療策略.

Wu 等［25］使用dCas9-DNMT3a 系統來精確修飾SAMRCA2啟動子的CpG島，評估SMARCA2啟動子甲基化在SMARCA2 轉錄調控中的作用和其在肺癌發展中的抑癌作用.發現SMARCA2在肺癌中的表達下降與拷貝數缺失和SMARCA2 啟動子高甲基化會導致SMARCA2的失活密切相關.證明SAMRCA2 啟動子的超甲基化在肺癌的發展中起致癌作用，利用CRISPR/dCas9 系統使其去甲基化，為臨床治療提供了潛在靶點.

Wang等［26］構建了基于dCas9-multiGCN4/scFv-TET1CD-sgRNA的SARI靶向去甲基系統，特異性的對起抑癌作用的IFN 調節的激活蛋白1 的抑制劑（SARI）區域進行去甲基化，證明了結腸癌中SARI 的下調依賴DNA 甲基化，進一步的體外和體內數據證實，dCas9-multiGCN4/scFv-TET1CDsgSARI通過調節腫瘤的增殖，凋亡和血管生成發揮抗腫瘤作用，對SARI啟動子的特異性去甲基化和恢復內源性SARI表達具有治療結腸癌和其他癌癥的作用.

4 應用CRISPR/dCas9 系統靶向調控去甲基化的展望

CRISPR/ dCas9 系統效率高、操作簡單的特性，使其成為靶向去甲基化編輯特定基因序列的強大工具.簡單快捷的操作系統和只需設計gRNA就可實現對靶基因進行調控，讓CRISPR/dCas9系統備受研究者的青睞，然而目前的實驗證據發現，CRISPR/dCas9系統仍存在脫靶效應較高的問題.雖然應用這種方法進行靶向DNA 去甲基化還處于起步階段，還需要展開大量的實驗研究，但隨著靶向表觀遺傳修飾工具和融合蛋白的不斷開發，高特異性和正確設計gRNAs 有望實現靶向DNA甲基化與去甲基化的精準調控，為表觀遺傳學的發展提供了新的方法，為表觀疾病的治療提供了可能.