侗醫(yī)藥松杖方對類風濕關節(jié)炎患者滑膜細胞STAT3炎癥信號表達的影響

安 陽，馬武開，黃 穎，曹躍朋，寧喬怡，劉 靜,楊慶萬，項飛燕

(1.貴州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550003；2.貴州省遵義市第一人民醫(yī)院，貴州 遵義 563000)

類風濕關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種以反復發(fā)作的四肢對稱性多關節(jié)腫脹、疼痛、功能障礙甚至關節(jié)畸形為特點的慢性自身免疫性疾病，基本病理表現(xiàn)為慢性滑膜炎。研究認為白介素17(Interleukin 17，IL-17)與RA的疾病進程緊密相關[1]，它主要由輔助性T細胞17(T Helper 17 cell，Th17)分泌,而信號轉導與轉錄激活因子3(Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)則通過調控核基因轉錄，控制著Th17的分化與成熟，并由此調控多種下游細胞因子如IL-6、IL-17、IL-21、IL-22、TNF-α等的表達[2]，最終形成STAT3-Th17正反饋通路，使炎癥信號逐漸放大。因此，針對STAT3的靶向調控，即可下調Th17的分化，有效控制RA的滑膜炎癥。松杖方是民間侗醫(yī)藥經(jīng)驗方，用于臨床中取得較好療效[3-4]。本研究通過松杖方的兔含藥血清干預的方法，觀察對人RAFS中STAT3及相關蛋白孤核受體γt(Orphan nuclear receptor gammat，ROR-γt)、細胞因子信號轉導抑制分子3(Suppressor of cytokine signaling-3，SOCS-3)的影響，探討松杖方的抗炎作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 滑膜細胞來源:滑膜組織取自貴州中醫(yī)藥大學(原貴陽中醫(yī)學院)第二附屬醫(yī)院骨科行關節(jié)置換術及我科行關節(jié)鏡診療術的RA患者，標本的獲取均通過患者知情同意。RA 的診斷符合ACR1987 年分類標準或EULAR2010年分類標準，并除外合并有感染、腫瘤、其他風濕病等情況，3個月內未使用慢作用抗風濕藥。

1.1.2 試劑及藥物:松杖方由松蘿、虎杖組成，兩藥各等分。雷公藤多苷(貴州漢方制藥有限公司)；來氟米特片(蘇州長征-欣凱制藥有限公司)；DMEM 高糖培養(yǎng)基(HyClone)；胰酶(HyClone)；胎牛血清(Gibico)；RIPA裂解液(上海碧云天生物技術有限公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；ROR-γt、SOCS-3及pSTAT3檢測試劑(英國ABCAM 公司)；細胞凋亡檢測試劑盒(Yeasen公司)。

1.1.3 儀器:恒溫培養(yǎng)箱(SANYO，MCO-20AIC，日本)；高速離心機(Eppendorf，5810R，德國)；顯微鏡(CKX-41，Olympus)；酶標儀(BioTek，EL×800 V，美國)。

1.1.4 實驗動物及含藥血清制備:新西蘭大白兔36只(貴陽中醫(yī)學院動物實驗中心提供)，雌雄各半，SF級，體重(2.0±0.2)kg。隨機分為六組，每組6只，即空白組、松杖方高、中、低劑量組、來氟米特組和雷公藤多苷組。松杖方高、中、低劑量組分別灌服成人等效劑量9倍、6倍、3倍生藥量溶液，雷公藤多苷對照組及來氟米特對照組灌服成人等效劑量雷公藤多苷和來氟米特混懸液，每天1次，連續(xù)1周，于末次給藥2 h后無菌條件下心臟取血，分離血清，組內血清混合，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與鑒定:充分分離RA滑膜組織，用PBS液清洗2遍，并剪成1 mm×1 mm大小的組織塊，放置在無菌瓶內，經(jīng)胰酶消化、離心處理后，取細胞置于DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5 %的CO2條件下培養(yǎng)24 h后，更換培養(yǎng)液，傳代至第3～5代，流式細胞儀檢測鑒定。取3代生長活躍的細胞進行實驗，根據(jù)分組給予相應含藥血清干預。

1.2.2 給藥劑量：根據(jù)人與兔體重換算公式進行計算，成人所需松杖方生藥量為1.05 g/kg，該劑量為低劑量，3倍為中劑量，9倍為高劑量，實驗時以PBS液稀釋含藥血清成相應濃度，取相應藥量；雷公藤多苷2.1 mg/kg，來氟米特0.7 mg/kg。實驗中直接給予相應劑量含藥血清。

1.2.3 流式細胞術檢測藥物對RASF細胞增殖的影響:取3代對數(shù)生長期RASF消化離心后，以10%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，接種至96孔板，細胞濃度約為5×104個/ml。實驗分設空白組、來氟米特組、雷公藤多苷組、松杖方高、中、低劑量實驗組，每組設3個復孔。取相應含藥血清加入每孔中干預，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收取細胞，按常規(guī)操作流式細胞儀檢測RAFS的凋亡情況。每組樣品檢測6次，采用FASCDiva軟件分析檢測結果。

1.2.4 Western blot法檢測RASF細胞ROR-γt、SOCS-3和STAT3、pSTAT3蛋白表達水平的影響:將PBMC或滑膜細胞低溫勻漿后加蛋白裂解液，置冰上40 min，4 ℃12000 r/min離心10 min，取上清。以BSA為標準，用Bradford 法對上清進行蛋白定量。取20 μg蛋白樣品，10% SDS-PAGE電泳，100 V轉移1 h至硝酸纖維素薄膜，放入封閉液中37 ℃封閉1 h；一抗4 ℃過夜。用不含抗體TBS-T液孵育作為陰性對照。反復洗膜后，將膜與堿性磷酸酶(AP) 標記的抗IgG抗體孵育，室溫輕搖1 h，洗膜后，用免疫印跡觀察，用圖像分析測定各帶吸光度(A)值做定量分析。

2 結 果

2.1 細胞形態(tài)的觀察 滑膜組織培養(yǎng)3～5 d，鏡下呈梭形、多角形、星形等多種形態(tài)，細胞呈漩渦狀排列生長，傳至3～5代后，RAFS生長密集，形態(tài)趨向于梭形，大小均一，折光性強，呈平行樣或者漩渦狀排列增殖，增殖速度較快。隨著傳代次數(shù)增多，細胞質中出現(xiàn)顆粒物質，生長緩慢，光亮度逐漸下降。本研究選擇3代細胞(圖1)。

圖1 滑膜細胞形態(tài)圖

2.2 松杖方含藥血清對RAFS凋亡的影響 檢測結果分析，各含藥血清干預組RAFS凋亡率與空白組比較均顯著升高(P<0.05)，松杖方含藥血清組細胞凋亡率與藥物濃度相關；松杖方中劑量組與雷公藤多苷組、來氟米特組間比較差異無統(tǒng)計學意義;松杖方高劑量組RAFS凋亡率最高，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 松杖方含藥血清對RA滑膜細胞凋亡的影響(%)

2.3 松杖方含藥血清對RASF的ROR-γt、SOCS-3和pSTAT3蛋白表達水平的影響 與空白組比較，各含藥血清干預組RAFS中ROR-γt、pSTAT3的表達量均下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中松杖方高劑量組ROR-γt、pSTAT3的表達量最低，與雷公藤多苷組及來氟米特組比較，差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)。而各含藥血清干預組RAFS中SOCS-3的表達量差異未見統(tǒng)計學意義 (P>0.05)。見表2(圖2)。

表2 松杖方含藥血清對RAFS的ROR-γt、SOCS-3、STAT3表達水平的影響

1.正常對照組；2.松杖方低劑量組；3.松杖方中劑量組；4.松杖方高劑量組；5.雷公藤多苷組；6.來氟米特組

3 討 論

RA是以關節(jié)滑膜炎癥損傷為特征的自身免疫性疾病，其發(fā)病機制復雜，有多種細胞因子參與其發(fā)病過程，而STAT3介導的炎癥通路占據(jù)重要地位[5-6]。STAT3屬于一類胞漿蛋白家族，在體內參與了多種炎癥因子的信號轉導過程，并參與調控滑膜細胞、T細胞等的增殖、分化。當IL-6、TGF-β與細胞膜上受體結合后，使JAK活化并招募STAT3蛋白并使其磷酸化，pSTAT3蛋白具有生物活性，以二聚體形式進入細胞核啟動轉錄程序，表達ROR-γt，激活ROR-γt信號傳導通路，從而介導初始T細胞向Th17分化[7-8]，導致大量炎癥因子生成并形成正反饋，進一步活化STAT3。STAT3活化后同時具有調控RAFS的增殖、分化、凋亡以及釋放炎癥因子的能力[9-10]，細胞因子具有強大的致炎功能，可直接作用于關節(jié)滑膜組織，導致滑膜炎癥持續(xù)、血管翳形成。

ROR-γt是類固醇激素受體家族成員，是重要的介導炎癥因子轉錄的調節(jié)因子，通過STAT3發(fā)揮作用。ROR-γt可以增強IL-17 mRNA轉錄，上調IL-17的水平[11-12]，繼而激活NF-κB通路并導致NF-κB相關炎癥因子如IL-1、IL-6、TNF-α等活性增強，促使多種炎癥因子協(xié)同作用[13],STAT3與細胞因子成相互促進的作用，最終形成STAT3-ROR-γt -Th17-炎癥因子-滑膜炎的環(huán)形炎癥軸鏈。而SOCS-3則可以抑制STAT3活性。SOCS是一類新型的細胞因子轉導抑制蛋白，其家族成員大都參與JAK-STAT信號通路的負反饋調節(jié)，而SOCS-3是其中之一，具有較強的生物活性。一旦抑制了STAT3的活性、破壞了環(huán)形炎癥軸鏈，就可以阻止滑膜炎癥。

侗藥的“風濕痛”與RA的臨床表現(xiàn)相符，該病因正氣不足、感受外邪，機體功能失調之后滋生內熱，是發(fā)病的關鍵，故治療上在“趕邪”時，也清內在“邪熱”。松杖方有松蘿、虎杖組成，具有祛風除濕、通絡止痛、清熱解毒、消腫理氣的功效，現(xiàn)代研究證實松蘿具有抑制炎癥、降低血清炎癥因子水平、抑制毛細血管生成等功效[14-15]，前期動物實驗證實松杖方可抑制CIA大鼠NF-κB信號通路，減少IL-1、TNF-α的分泌[16-17]。本研究顯示中、高劑量的松杖方可下調pSTAT3的表達，各劑量組均可下調ROR-γt的表達，抑制強度與藥物劑量相關。說明松杖方可同時抑制ROR-γt、pSTAT3的基因表達，抑制炎癥信號的傳導，促進RAFS凋亡，阻斷RA炎癥持續(xù)發(fā)生。