阿膠及其制品質量檢測方法研究進展

林曉伊 - 李 亙 王馮宇 - 陳 毓

(杭州醫學院檢驗醫學院，浙江 杭州 310053)

阿膠又名驢皮膠、盆覆膠、傅致膠，是由馬科動物驢的干燥皮或鮮皮經煎煮、濃縮制成的固體膠[1]，含有豐富的糖類、必需氨基酸、多不飽和脂肪酸[2]、脂質及人體所必需的多種微量元素[3]，具有益智健腦、改善皮膚[4]、補血止血、強抗氧化性[5]和提高免疫[6]等功效，既可作為保健品食用，也可用于藥膳中達到治療與營養雙重目的[7]，因而身價倍增。

隨著消費升級，中國老齡人口數量逐步增多，阿膠需求量不斷增加，而驢皮原料供不應求[8]。據《2021年中國阿膠行業分析報告—市場競爭現狀與發展趨勢分析》[9]顯示，中國阿膠行業產量約為6 000 t，需要驢皮約480萬張，而國內可供應的驢皮不足200萬張，這促使部分生產企業從海外謀取驢皮，使得驢皮原料成本大大增加。而不法分子為謀高利，通過縮減驢皮使用量或者使用豬皮、馬皮等其他動物皮代替驢皮來制造假劣阿膠[10]，不利于行業良性發展。

研究[11]表明，不同動物皮熬制的膠有著與阿膠不同甚至相悖的功效，食用假冒劣質的阿膠存在安全隱患。由于阿膠制作工藝復雜[12]，原料結構破壞、成分改變致使阿膠的質量鑒定變得相對困難[13]。因此，如何準確測定阿膠及其各種衍生制品的驢皮成分及如何對產品中動物源性成分進行檢測一直是阿膠鑒定研究過程中的難點與重點。

目前，阿膠及其制品的主要檢測方法有紅外光譜法、蛋白質電泳法、高效液相色譜法、液相色譜—質譜法[14]、聚合酶鏈反應(PCR)、DNA條形碼技術、低場核磁技術[15]等。其中，液相色譜—質譜法是中國測定阿膠制品中氨基酸含量的標準方法，光譜法主要應用于快速檢測，而多重PCR、熒光實時定量PCR、DNA條形碼技術等可通過靶標物質的鑒別進行物種溯源，為阿膠檢測提供了新的方向；電泳法、高效液相色譜法有強大的分離分析能力，可對摻假的阿膠制品進行進一步的定量。文章擬綜述近年來常見阿膠制品的各種質量檢測方法，旨在為高效檢驗阿膠質量、完善阿膠質量標準、加強阿膠市場監控提供參考。

1 阿膠及其制品質量檢驗

1.1 紅外光譜法

紅外光譜法以無損、快速的檢測優點在阿膠快速檢測領域有著較廣應用[16]。張仁霞等[17]運用傅立葉變換紅外光譜(FTIR)法，對加入了KBr粉末的樣品供試片進行掃描，在波數為4 000～400 cm-1的范圍內對阿膠配方顆粒進行成分分析。其特定成分在特定區域具有強而復雜的吸收峰群，通過對比吸收峰特征的差異，可有效鑒別出各種阿膠樣品的輔料成分；高鳳偉等[18]采用近紅外光譜技術結合Fisher模型，在波數為12 820～4 000 cm-1的范圍內對豬皮明膠、牛皮明膠和驢皮明膠進行了主成分(PCA)分析，其預測識別率可達100%，可用于驢皮阿膠的快速鑒定；Li等[19]采用Antars II FT-NIR光譜儀對福牌阿膠樣品進行檢測，可有效分析阿膠存放年限與其中營養物質含量的相關性，但在定性和定量方面有待提升。

在紅外光譜測定中，波數范圍在12 500～4 000 cm-1的近紅外(NIR)區以及波數范圍在4 000～400 cm-1的中紅外(MIR)區均可應用于食品的檢測分析，其中MIR比NIR有著更加清楚可辨別的光譜峰值，因此相比近紅外光譜技術，傅立葉變換紅外光譜法具有更優的鑒別能力。傅立葉變換紅外光譜法檢測速度快，但檢測靈敏度低，對于驢皮成分含量較低的阿膠制品難以檢測，不適合做痕量分析；而近紅外光譜法雖然需要大量已知的代表性樣品作模型，但其檢測儀器便攜且成本較低，作為小批量樣品現場快速檢測分析方法較為普遍。

1.2 蛋白質電泳法

阿膠中含有核心蛋白聚糖、雙糖鏈蛋白聚糖等富含亮氨酸的活性蛋白[20]，其中帶電荷的成分(膠原蛋白及其水解產物)能夠在電場的作用下泳動，因此可采用電泳法進行膠類藥材的鑒別。付英杰等[21]基于Tricine-SDS-PAGE法，采用硫酸銨鹽析法對樣品進行純化處理，并利用胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶和木瓜蛋白酶4種不同的蛋白酶分別對樣品進行酶解處理，通過對酶解液電泳所得電泳條帶經銀染色后對比分析，最后對不同膠類藥材按氨基酸排列順序進行有效分類，發現硫酸銨鹽析法處理樣品所得條帶不清晰，僅用脫脂棉過濾便可進行樣品純化。而對比不同的蛋白酶處理樣品時發現木瓜蛋白酶會干擾檢查結果，不建議用于阿膠測定。由于各種動物膠氨基酸排列順序不同，其酶解產物的電泳圖也大不相同，可提示膠類藥材種類的差異；李楠等[22]利用Tricine-SDS-PAGE法，制備了聚丙烯酰胺凝膠對3種不同膠類藥材進行分離，并用考馬斯亮藍染色后觀察電泳圖譜，以實現對蛋白質在膠類藥材加工過程中的動態變化規律的分析。結果顯示，驢皮、龜甲、鹿角的蛋白質在10～250 kDa區域內均有分布，其中驢皮樣品的條帶數較多，其中有3條較為清晰的條帶可與其他膠類藥材進行區別，而不同加工程度的膠類藥材中的蛋白質降解程度不同，僅可通過蛋白質在泳道中呈現的彌散現象初步判定。

阿膠中蛋白質的相對分子質量為15～250 kDa，經過酶解處理后易形成小分子多肽，在對電泳產物的染色上，考馬斯亮藍染色法難以清楚染色，銀染色法相對更好。在Tricine-SDS-PAGE法中，一些相對分子質量低于10 kDa 的小分子多肽在電泳分析的過程中容易丟失，分辨率較低。且Tricine-SDS-PAGE法無法清晰區分較為相近的特征條帶，只能作為膠類藥材粗略分類判讀的依據，如將阿膠與龜甲膠、鹿角膠等進行區分，然而該技術無法準確辨別出阿膠制品是否存在摻偽現象。總的來說，電泳技術在對阿膠原料基源鑒別上還尚缺乏論證，目前在阿膠檢測方面往往是作為其他檢測方法的輔助手段。

1.3 高效液相色譜法

高效液相色譜法在阿膠及其制品質量檢測中應用較為普遍，主要是對于阿膠制品中含有的4種主要氨基酸成分(L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸)進行分析鑒定[23]，以作為阿膠真偽優劣判定的主要依據。另外，該法還可以對阿膠中核苷類化合物含量進行對比分析[24]。

Xie等[25]采用高亞膠束液相色譜梯度洗脫法，以十二烷基硫酸鈉溶液—乙酸銨作為流動相A，乙腈作為流動相B有效分離出阿膠中的氨基酸，并對梯度洗脫條件進行優化，利用氨基酸含量的差異進行阿膠的區分；汪明志等[26]將異硫氰酸苯酯作為衍生劑，采用柱前衍生—反相高效液相色譜法分析阿膠補血口服液中主要氨基酸含量。該方法雖會受阿膠組成成分的影響，但其氨基酸的平均回收率高，操作簡便，對阿膠中氨基酸的檢測分析有重大參考價值。

對于高效液相色譜法分離測定氨基酸來說，流動相的組成及配比對氨基酸的分離效果有著較大的影響，優化后的亞膠束液相色譜法可實現對混合物快速準確分離，對于分析阿膠這種成分復雜的制品具有較好的應用價值，但分析時間相對較長。經典的氨基酸分析方法是采用柱后衍生法，隨著反相柱柱前衍生化法的產生和發展，免去的柱后衍生化法的復雜儀器裝備，柱前衍生—反相高效液相色譜法以異硫氰酸苯酯作為衍生劑，可形成較為穩定的產物供測定用，使混合物更容易分離，具有較高的準確性、靈敏度，但需要注意衍生化試劑峰對結果的影響，進行區分辨別。

1.4 超高效液相色譜—質譜聯用法

隨著相關物種特異性肽的發現及聯用技術的日趨成熟，膠類制品的真偽鑒別也逐步趨向于儀器聯用技術，對動物膠制品的質量評價有重大意義[27]。王超等[28]采用UPLC-MS法對市售阿膠保健食品中4種主要氨基酸成分進行測定，結果顯示阿膠中的阿膠主成分與阿膠中藥材相近，且對于部分保健品中的阿膠含量難以測定，表明該法雖檢測靈敏度高，但區分度較低，尚缺乏專項測定能力；Cheng等[29]采用超高效液相色譜—四極—飛行時間質譜法結合了胰酶消化樣品進行PCA分析，鑒定PCA載荷圖給出的標記肽對5種膠類藥材進行了有效分類。該方法有較強的專屬性，可對常用明膠的變異鑒別提供有效的技術支持。

總的來說，色譜—質譜技術的聯用比單一的色譜技術進一步提高了靈敏度和準確性，專屬性強[30]，能更好地對成分進行定量，但該類方法儀器價格高昂，難以推廣應用。其中超高效液相色譜—四極—飛行時間質譜法易受膠類制品中的輔料的影響，容易對檢測結果造成偏差，還需改進樣品前處理技術，通過富集蛋白質以減少輔料影響。

1.5 聚合酶鏈式反應

目前，在阿膠制品中DNA提取及物種源性分析方面主要依靠分子生物學手段。張全芳等[31]基于阿膠中的DNA因加工工藝而發生降解的變化規律，建立了用SDS-蛋白酶K結合Chelex-100法對市面上所售的阿膠制品如阿膠補血口服液進行微量DNA的提取，并用瓊脂糖凝膠電泳法對阿膠DNA提取方法進行成功驗證，為阿膠及其制品DNA提取困難開辟新道路。但對于摻假的阿膠樣品來說，能從中檢測出驢DNA并無法說明阿膠中是否含有其他動物的皮膠，因此，同時對阿膠中所含有的DNA進行種源的分析也是阿膠鑒定的關鍵所在[32]。諶陽等[33]采用多重PCR，基于核質遺傳原理進行皮張種源性分析，特異性高，可有效排除樣品中非目的成分的干擾。

Zhang等[34]選擇了高特異性、高敏感性的探針/引物對多種阿膠制品中驢的DNA進行分析，并同時尋找出可能進行摻雜的其他動物源DNA，如馬、牛、豬等；Liu等[35]采用了含有指定含量的驢皮、豬皮混合物來建立體系，并基于單拷貝內膽核作為參考引物，使用實時熒光定量PCR法對阿膠樣品進行檢測評價；趙云東等[36]提取、克隆市售阿膠制品中目的DNA片段，以重組質粒pGMT-Equ66bp作為陽性對照，并將檢測結果與質譜檢測結果作對比，建立了阿膠中動物源性DNA成分的定量檢測方法。

綜合來說，實時熒光定量PCR方法可在混合動物產品中特異地鑒定出驢皮并量化驢皮明膠的含量。TaqMan探針法在純度的鑒定上具有較大優勢，可實時檢測，免去了對擴增產物的電泳分析，避免了后續分析操作對結果造成的影響，然而TaqMan探針法中所使用的探針設計較復雜，價格昂貴，檢測成本相對偏高。

1.6 DNA條形碼技術

DNA條形碼技術作為一種新的生物識別技術，常利用線粒體基因如細胞色素b基因、12S rDNA、16S rRNA等來鑒定動物源性[37]，可更加高效地對阿膠制品的成分進行生物物種識別。目前用于鑒定動物皮張源性的條形碼技術通常使用680 bp的線粒體COI序列作為靶標，結合PCR技術，可有效解決阿膠DNA數量少的檢測難題。其常用的通用引物序列是LCO1490(5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’)及LCO2198(5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’)[38]。

嚴華等[39]通過供試品處理、DNA提取、PCR擴增線粒體COI上的目的片段、PCR產物的純化測序、序列拼接及進行序列比對和遺傳距離分析等一系列流程，進行阿膠原料的基源鑒別。該法將擴增序列與BOLD數據庫、GenBank數據庫等進行比對，能快速、準確地檢測阿膠的原料來源，如能將其與數據庫結合，構建起方便、可靠的信息溯源系統，便可實現阿膠制造流通過程中的監管。但如何對樣品進行處理、采取的引物濃度是多少、PCR程序如何設計等都還需要進一步探索研究。

盡管DNA條形碼技術仍存在一些缺陷：如線粒體基因向核內轉移導致無法有效檢測、難依據單基因片段實現所有物種鑒定、相關數據庫不夠完善等，但對比傳統物種鑒定法，它采用數字化形式，利用有機體的殘片，減少經驗依賴，并能夠快速進行阿膠信息的采集比對并加以應用，現已在多數動植物中藥材中得以成功應用[40]，而更多相關數據庫的創建擴充對阿膠檢測也有著重要意義。

近期，Bohmann等[41]主張無需進行任何計算的密集型預處理，就可將完整的核酸序列用于確認生物身份(稱為“DNA-mark”)，這進一步完善了以DNA為基礎的分類鑒定，甚至可以用基因組略讀來替代條形碼PCR。

1.7 低場核磁(LF-NMR)技術

LF-NMR技術以其簡便的操作過程，無需進行復雜的預處理能節約試劑及樣本的優點，在食品中得以普及應用，在阿膠摻偽鑒定上也有著較大應用價值。

姜嬌嬌[42]采用LF-NMR儀對阿膠進行快速檢驗，用主成分分析法和逐步判斷分析法分析了純阿膠與摻偽阿膠間的差別，并對摻偽阿膠不同摻偽比例進行區分。結果表明所測7個廠家不同阿膠樣品的弛豫時間與峰面積均不相同，結合主成分分析法，可推測出不同輔料及加工工藝會引起H質子狀態的差異，對快速鑒定不同品牌阿膠有著較大意義。通過逐步判斷分析法，依據得分模型可對各個摻偽阿膠中摻假物質的最低檢出限進行確定。對于測定數據的分析，逐步判斷分析法比主成分分析法在分析類別間差異上有著更加顯著的區分效果。

2 結論與展望

阿膠及其制品質量檢測技術主要是針對于阿膠中的特異性成分(氨基酸、核酸)采用合理方法進行成分測定。目前阿膠及其制品因深加工工藝致使阿膠性狀改變、結構破壞、核酸降解，提取、濃縮、富集、測定等環節存在干擾因素影響檢測技術的發展。

通過對阿膠質量檢測評估方法的總結發現，紅外光譜法易受深加工制品加工程度的影響，導致準確性較低，已不能完全滿足日常監督檢驗的需求；Tricine-SDS-PAGE法存在著特異性和靈敏度較低的局限，僅作為膠類藥材粗略分類判讀的依據。近年來，隨著相關科學研究的深入，阿膠檢驗技術趨于多樣化，在分子生物學檢驗領域取得了有效成果。熒光實時定量PCR在阿膠檢測方面的應用靈敏度高并且鑒別結果特異性強，為阿膠真偽鑒別、優劣鑒定提供有效手段。隨著生物信息學數據庫的不斷更新完善，DNA條形碼技術也愈發成熟，為國內外食品安全保駕護航。同時，HPLC技術因不破壞樣品結構的優點而被廣泛應用于阿膠等中藥材的鑒別，也是目前國際上普遍認可的食藥制品質量評價與控制的先進技術，具有操作簡便、結果準確、分析時間短及重復性好的優勢，可對阿膠摻假檢測進行定量分析。而LF-NMR技術也以其能快速高效地鑒定阿膠摻偽程度，為阿膠鑒定提供了新方向。

對于阿膠質控來說，應在鑒別時綜合考慮多方面因素，重點在于驢皮與其他動物皮之間專屬性成分的鑒定，并探索建立多學科、多面檢測技術集成的方法，例如：用HPLC法聯合DNA條形碼技術來進行阿膠真偽的鑒別，通過對DNA序列的差異性、樣品中氨基酸的含量平均值和RSD進行綜合判別，不僅重復性好，分析時間也較短，能夠明確驢皮與其他動物皮基因序列的差異以及氨基酸含量與質量優劣的關聯性，將成為阿膠檢測方法中較有應用前景的鑒別方式之一。