橫紋肌肉瘤中融合基因陽性和陰性細胞功能學及差異miRNA生物信息學分析

王曉萌，李真真*，孟 蓮，張海俊，黨鴻蔚，李 鋒，劉春霞

橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma, RMS)好發于兒童及青少年[1]，常見亞型為胚胎性橫紋肌肉瘤(embryonal RMS，ERMS)、腺泡型橫紋肌肉瘤(alveolar RMS，ARMS)，ERMS發病率約60%，ARMS發病率約20%；由于ARMS中存在PAX3/PAX7-FOXO1融合基因，其惡性程度高，致死率更高[2]。已在成肌細胞模型中發現PAX3-FOXO1的表達可以促進RMS的發展[3]。因此，全面探索融合基因在RMS細胞中發揮的作用就顯得尤為重要。

miRNA作為一種非編碼RNA，對癌癥的抑制或表達發揮重要作用。miR-27a等不同miRNA可以促進RMS侵襲、遷移等生物學行為[4]，但尚未見在RMS細胞中比較融合基因陽性和陰性的生物學行為的研究，融合基因和miRNA的相關研究較少。因此，該文將比較RMS細胞融合基因陽性和陰性的生物學行為并結合生物信息學分析差異miRNA，為后續基因及信號通路的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞系和細胞培養人RD和PLA-802細胞系購自中國科學院細胞庫； RH30細胞系購自上海復翔生物技術有限公司；PLA-802、RH30和RD細胞的培養基為含10%胎牛血清的DMEM培養基(美國賽默飛公司)，在37 ℃、5%CO2培養箱中培養。

1.2 主要試劑Cell Counting Kit-8購自上海東仁化學技術有限公司；Total RNA Kit、miScript II RT Kit、miScript SYBR Green PCR Kit均購自德國QIAGEN公司；Ultra SYBR Mixture(Low ROX)購自北京康為世紀公司；TIAN Script RT Kit購自北京天根生物科技公司；Transwell小室購自美國Corning Coster公司；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物有限公司；miRNA引物購自上海生工生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1CCK-8試驗 在96孔板中(3×103個/孔)接種RMS細胞，分別在0、24、48和72 h，向RMS細胞中加入CCK-8試劑(10 μl/孔)，并在37 ℃、5%CO2的潮濕培養箱中孵育2 h。避光使用Biotek酶標儀(美國Bio-Rad)記錄450 nm的吸光度(optical density, OD)值。

1.3.2Transwell試驗 收集RMS細胞(200 μl，25 000個/孔)。侵襲試驗需提前2 h在小室內加入基質膠，隨后更換DMEM培養基水化30 min，無血清培養基重懸RMS細胞后置于小室內，將小室置于20%FBS的600 μl DMEM培養基的24孔板中孵育2 d，小室用4%多聚甲醛固定20 min后晾干，用0.1%結晶紫染色15 min后用棉球輕輕擦拭上層，在顯微鏡下拍照記錄。遷移試驗則無需鋪基質膠，在37 ℃下孵育24 h后，后續實驗步驟同遷移試驗。利用Image J軟件計數和SPSS統計分析。

1.3.3流式細胞術 將細胞鋪到6孔板(1×104個/孔)中，2 d后，消化收集RMS細胞，用預冷PBS洗滌2次，以1×106個/ml的濃度重懸于500 μl Binding Buffer中。向RMS細胞懸液中加入Annexin VAPC/PI雙染試劑各5 μl。雙染后1 h之內利用流式細胞儀檢測凋亡細胞的百分比，并記錄凋亡率。

1.3.4差異miRNA分析 利用GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)數據庫中GSE97553數據集，包含患者的PAX3-FOXO1融合基因陰性細胞(3株：RD、RH2、RH18)和PAX3-FOXO1融合基因陽性細胞(5株：RH3、RH4、RH30、RH28、RH41)的miRNA芯片表達譜，運用在線軟件GEO2R分析融合基因陽性和陰性細胞的差異miRNA， SangerBox分析差異miRNA繪制火山圖， |log2FC| >3，P<0.05，設定篩選差異miRNA為有意義的閾值。

1.3.5qRT-PCR檢測篩選miRNA RMS細胞鋪到12孔板培養2 d后消化離心，棄上清液，加入700 μl QIAzol 裂解試劑混勻靜置5 min，加入140 μl三氯甲烷混勻，室溫靜置15 min后離心，吸上清液加入1.5倍體積的無水乙醇混勻后，吸700 μl液體加入柱子上離心10 000 r/min，15 s，4 ℃。利用Total RNA Kit試劑盒提取總RNA，將提取miRNA測濃度后，試劑盒miScript II RT Kit進行逆轉錄，聯合SYBR Green PCR Kit試劑盒上樣后利用7500實時PCR進行檢測，統計分析結果。

2 結果

2.1 融合基因陽性RH30細胞的遷移、侵襲能力最強RMS細胞培養24 h后，統計RH30細胞、RD細胞和PLA-802細胞的穿孔數量，結果顯示RH30細胞的遷移能力高于RD細胞和PLA-802細胞(F=226.514，P均=0.000)。RMS細胞培養48 h后，統計RH30細胞和RD細胞、PLA-802細胞的穿孔數量，結果顯示RH30細胞的侵襲能力高于RD細胞和PLA-802細胞(F= 90.917,P均=0.000)。 見圖1。

2.2 融合基因陰性RD細胞的增殖能力最強分析3株RMS細胞在0、24、48和72 h的OD值，并繪制OD曲線。0 h時RD、RH30和PLA-802細胞的OD值曲線結果顯示各組之間無差異(F=0.293，P>0.05)。在24、48、72 h時，RD細胞的增殖能力高于RH30和PLA-802細胞的增殖能力(F=29.16，PRH30=0.004，PPLA-802=0.000；F=109.726，PRH30=0.000，PPLA-802=0.000；F=56.646，PRH30=0.001，PPLA-802=0.000)(P<0.05)。此外，RH30細胞的增殖能力高于PLA-802細胞的增殖能力。所有結果差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖1 3株RMS細胞系的遷移和侵襲能力

圖2 3株細胞系的細胞增殖能力

2.3 融合基因陽性RH30細胞的抗凋亡能力最強在RMS細胞中加入Annexin V-APC / PI試劑后檢測其凋亡能力，結果顯示RH30細胞的凋亡率低于RD細胞和PLA-802細胞(F=7.415，PRD=0.015，PPLA-802=0.016)。PLA-802細胞與RD細胞之間的凋亡率差異無統計學意義(t=-0.040，P=0.97)。3株RMS細胞中，RH30的抗凋亡能力高于RD和PLA-802。見圖3。

2.4 篩選差異miRNAGEO2R分析RMS中融合基因陽性細胞和融合基因陰性細胞中差異miRNA，利用sangerbox中火山圖分析差異miRNA，紅色代表上調miRNA，綠色代表下調miRNA(圖4)。根據|log2FC|>3，P<0.05，篩選得到12個差異miRNA，其中上調miRNA有3個，分別為miR-1、let-7d-5p和let-7b-5p，下調miRNA有9個，分別為miR-196a-5p、miR-455-3p、miR-21-5p、miR-193a-3p、miR-29b-3p、miR-29a-3p、miR-100-5p、miR-222-3p和miR-221-3p(表1)。

表1 篩選差異miRNA

2.5 qRT-PCR驗證差異miRNA在RH30細胞、PLA-802細胞、RD細胞中利用qRT-PCR檢測篩選出的12個差異miRNA，結果顯示miR-1(F=28.908，PRD=0.001，PPLA-802=0.000)，let-7d-5p(F=187.469，PRD=0.000，PPLA-802=0.000)和let-7b-5p(F=2920.115，PRD=0.000，PPLA-802=0.000)在融合基因陽性RH30細胞中表達高于融合基因陰性PLA-802細胞和RD細胞(圖5)；miR-196a-5p(F=98.196，PRD=0.000，PPLA-802=0.001)，miR-455-3p(F=8.773，PRD=0.006，PPLA-802=0.040)，miR-21-5p(F=187.469，PRD=0.000，PPLA-802=0.000)，miR-193a-3p(F=87.856，PRD=0.000，PPLA-802=0.002)，miR-29b-3p (F=16.142，PRD=0.001，PPLA-802=0.044)，miR-29a-3p(F=16.573，PRD=0.006，PPLA-802=0.002)，miR-100-5p(F=13.040，PRD=0.002，PPLA-802=0.038)，miR-222-3p(F=53.234，

圖3 3株細胞系的抗凋亡能力

圖4 火山圖分析差異miRNA

PRD=0.000，PPLA-802=0.003)和miR-221-3p(F=48.550，PRD=0.000，PPLA-802=0.003)在融合基因陰性RD細胞和PLA-802細胞中表達高于融合基因陽性RH30細胞(圖5)。上述結果與生物信息學分析結果一致。

圖5 qRT-PCR分析篩選差異miRNA的mRNA表達

3 討論

ARMS中75%～80%存在t(2;13)(q36;q14)/PAX3-FOXO1或t(1; 13)(p36; q14)/PAX7-FOXO1易位，對RMS的發生發展起重要作用[5]。Williamson et al[6]在210位RMS患者中運用Kaplan-Meier分析無病生存率和總體生存率，結果顯示融合基因陽性RMS患者的轉移比例高于融合基因陰性的RMS患者，融合基因陽性患者比融合基因陰性患者預后差。本文在RMS細胞學水平證實，融合基因陽性RH30細胞的侵襲、遷移和抗凋亡能力高于融合基因陰性PLA-802細胞和RD細胞，而CCK-8檢測結果顯示RD 的增殖能力高于RH30和PLA-802，融合基因可能對RMS細胞的侵襲、遷移及抗凋亡能力起主要作用，對RMS細胞的增殖能力影響較小，可做進一步研究，為RMS的分子信號通路研究提供參考。

miRNA不僅參與正常的細胞生物進程，在腫瘤中同樣發揮重要的作用。在乳腺癌細胞中過表達miRNA-144抑制CEP55的表達，抑制乳腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移[7]。在RMS中，融合基因不僅影響腫瘤細胞的生物學功能，對miRNA同樣發揮重要作用，過表達PAX3-FOXO1激活促進miR-486-5p的表達，進而促進ARMS的發展[8]。

本研究利用生物信息學分析miRNA芯片表達譜篩選RMS融合基因陽性和陰性的差異miRNA并利用qRT-PCR證實miR-196a-5p、miR-455-3p、miR-193a-3p、miR-100-5p、miR-222-3p和miR-221-3p等在RMS融合基因陽性中的表達低于融合基因陰性的RMS，在RMS融合基因陽性中可能發揮抑制作用。

Zhan et al[9]發現在胰腺癌中miR-455-3p表達降低，PDZ結合基序(TAZ)為Hippo途徑的關鍵因子，過表達miR-455-3p靶向抑制TAZ表達抑制胰腺癌細胞的增殖。Mohamed et al[10]研究表明在RMS中TAZ促進RD(ERMS)細胞的增殖及成肌細胞轉化。Lu et al[11]發現在耐西妥昔單抗的大腸癌中miR-100過表達，lncRNA MIR100HG可以驅動miR-100和miR-125b協調抑制Wnt信號通路的負調控因子，增強Wnt信號表達導致耐藥，不利于腫瘤的治療。Singh et al[12]在p53和c-fos雙突變表達降低的小鼠模型體內發現，與正常成肌細胞相比，ERMS中的Wnt信號通路被下調。Xu et al[13]研究表明miR-196a-5p是唯一連接LOC134466和TAC1的miRNA，過表達LOC134466可抑制miR-196a-5p，促進TAC1的表達，抑制子宮內膜癌細胞的增殖。Wang et al[14]在肝癌中利用生物信息學分析及實驗證實miR-221-3p/miR-222-3p高表達，其預測靶基因CBFB、UBE2N在肝癌預后預測表現良好，可能是肝癌預后的指標。本研究miR-221-3p/miR-222-3p等miRNA在RMS融合基因陰性的表達高于融合基因陽性，上述研究為RMS中研究差異miRNA提供參考，可利用miRNA做進一步研究。

綜上，融合基因陽性的RMS細胞侵襲、遷移和抗凋亡能力高于融合基因陰性RMS細胞，融合基因對差異miRNA的表達可能起重要作用，這為深入研究融合基因在RMS的分子作用機制及靶向藥物的研究奠定基礎。