Micro PET/CT觀察三七總皂苷對腦缺血再灌注損傷大鼠模型腦葡萄糖代謝的影響

彭一檬，余 錄，譚 華，尤 強(qiáng)，張春銀*

(1.遂寧市中心醫(yī)院放射科，四川 遂寧 629000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，四川 瀘州 646000)

腦缺血再灌注損傷病理生理反應(yīng)較為復(fù)雜。葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(glucose transporter, GLUT)可能是治療腦缺血再灌注損傷的新靶點，上調(diào)GLUT表達(dá)有利于缺血缺氧腦組織轉(zhuǎn)運葡萄糖，從而緩解能量代謝衰竭，維持細(xì)胞內(nèi)外離子濃度梯度，減輕腦組織水腫[1]。三七總皂苷(Panax notoginseng total sapoins， PNS)對大鼠腦缺血再灌注損傷模型具有神經(jīng)保護(hù)作用[2]。本研究采用Micro18F-FDG Micro-PET/CT半定量分析腦缺血再灌注損傷模大鼠型腦葡萄糖代謝，以免疫組織化學(xué)分析GLUT表達(dá)，觀察PNS對腦缺血再灌注損傷大鼠腦葡萄糖代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6～8周齡健康雄性SD大鼠40只，由西南醫(yī)科大學(xué)動物中心提供[許可證號：SCXK(川)2018-065]；清潔級Ⅱ級，體質(zhì)量250～300 g，以標(biāo)準(zhǔn)動物飼料喂養(yǎng)，12 h明暗交替光照。采用單純隨機(jī)抽樣法將大鼠分為正常組、模型組、假手術(shù)組及PNS組，每組10只。

1.2 建立模型 采用改良線栓法建立大腦中動脈阻塞再灌注(middle cerebral artery occlusion/reperfusion， MCAO/R)模型[3]。對模型組及PNS組大鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg體質(zhì)量)麻醉，于頸前偏右側(cè)切口，鈍性分離并暴露右側(cè)頸部血管，結(jié)扎并剪斷頸外、頸內(nèi)-外交通動脈后結(jié)扎翼鄂動脈，夾閉頸總動脈，頸內(nèi)動脈繞線備用；于右頸外動脈近心端剪一倒“V”形小口，經(jīng)此插入線栓(直徑約為0.32 mm)，插入1.8～2.0 cm后遇到阻力立即停止；結(jié)扎備用線，固定線栓后松開動脈夾；阻斷1 h后拔出線栓，逐層縫合術(shù)區(qū)組織。假手術(shù)組插線深度約1.0 cm，1 h后拔出線栓縫合組織，其余操作相同。正常組僅麻醉，不予手術(shù)。

參照文獻(xiàn)[4]標(biāo)準(zhǔn)評價神經(jīng)功能缺損：神經(jīng)功能正常為0分；提尾時，大鼠左前肢伸展程度與對側(cè)不一致為1分；自由行走時向左側(cè)轉(zhuǎn)圈為2分；自由行走時向左側(cè)傾倒為3分；無自發(fā)行走，但意識存在為4分；死亡與缺血有關(guān)為5分。術(shù)后2 h評分為1～4分且Micro PET/CT顯示右側(cè)大腦半球出現(xiàn)糖代謝減低區(qū)提示判斷造模成功。排除造模不成功及意外死亡大鼠，隨機(jī)抽取同級別大鼠進(jìn)行補(bǔ)充造模，保證模型組及PNS組各10只，共20只大鼠為腦缺血再灌注損傷模型。

1.3 藥物干預(yù) 以建模成功后3 h為干預(yù)起始時間點，對PNS組每日1次經(jīng)腹腔注射PNS(濃度11.5 mg/ml)，劑量為115 mg/kg體質(zhì)量[5]，連續(xù)3日給藥；其余3組以等體積(10 ml/kg體質(zhì)量)0.9%生理鹽水代替PNS。

1.4 PET/CT掃描及圖像分析 采用Siemens Inveon Multimodality System Micro PET/CT，配備Inveon集成工作平臺和ASI Pro VM分析軟件系統(tǒng)。18F-FDG(放射化學(xué)純度>98%，pH為5.6)由西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科提供，以Siemens Cyclotron RD型加速器制備。分別于造模成功后2、6、24、48及72 h進(jìn)行顯像，之前均停飼8 h并測定空腹血糖。俯臥位保定大鼠，腹腔麻醉后，經(jīng)尾靜脈注射18F-FDG 18.5～37.0 MBq(約0.2 ml)，40 min后采集圖像：CT采集曝光200 ms，以COBRA濾波反投影(filter back projection， FBP)進(jìn)行重建，PET采集耗時約10 min，以2D-FBP進(jìn)行重建。由2名具有2年以上工作經(jīng)驗的醫(yī)師采用ASI Pro VM軟件觀察腦缺血部位及范圍,勾畫感興趣容積(volume of interest， VOI),以糖代謝減低區(qū)為VOI 1，其鏡像區(qū)域為VOI 2，測量標(biāo)準(zhǔn)攝取值(standardized uptake of value， SUV)。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測腦GLUT 兔抗鼠GLUT-1及GLUT-3抗體購自Bioworld公司。于建模成功72 h且PET/CT顯像后摘取大鼠腦組織，制作石蠟切片，行免疫組織化學(xué)染色，以Image J軟件測定平均光密度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 24.0統(tǒng)計分析軟件，計量資料以±s表示，以重復(fù)測量方差分析比較各時間點組間及組內(nèi)SUV差異；以獨立樣本t檢驗比較組間GLUT平均光密度值，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.118F-FDG Micro PET/CT圖像視覺及SUV 正常組及假手術(shù)組大鼠腦實質(zhì)葡萄糖糖代謝均勻。模型組及PNS組大鼠術(shù)后2 h 右側(cè)大腦半球均見葡萄糖代謝減低區(qū)，18F-FDG攝取明顯低于鏡像側(cè)；術(shù)后6 h缺血灶糖代謝減低程度加重、范圍稍擴(kuò)大，此后模型組糖代謝減低區(qū)范圍變化不明顯，PNS組糖代謝減低區(qū)范圍逐漸縮小，18F-FDG攝取逐漸增高，見圖1。

2.2 缺血灶及周圍腦組織SUV 術(shù)后2 h 正常組、模型組、假手術(shù)組及PNS組間SUV差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。術(shù)后6、24、48及72 h，模型組及PNS組SUV均低于正常組和假手術(shù)組(P均<0.05)，而PNS組均高于模型組(P均<0.05)。術(shù)后6 h 缺血灶18F-FDG攝取水平達(dá)到最低，之后SUV不同程度恢復(fù)；各時間點正常組及假手術(shù)組SUV差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，見表1。

2.3 GLUT-1及GLUT-3表達(dá) GLUT-1主要表達(dá)于微血管內(nèi)皮細(xì)胞(圖2)，GLUT-3主要表達(dá)于神經(jīng)元細(xì)胞(圖3)，陽性表達(dá)細(xì)胞呈棕黃色；正常組和假手術(shù)組GLUT-1、GLUT-3陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)目均少于模型組和PNS組。術(shù)后72 h 模型組及PNS組GLUT-1和GLUT-3平均光密度值均高于正常組(P均<0.05)，模型組高于假手術(shù)組(P<0.05)，PNS組高于模型組及假手術(shù)組(P均<0.05)；假手術(shù)組GLUT-1(t=-1.88，P=0.07)及GLUT-3平均光密度值(t=-1.2，P=0.21)與正常組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

3 討論

缺血、缺氧時，腦組織主要依靠無氧酵解，ATP減少、ADP增加，線粒體等細(xì)胞器因缺乏營養(yǎng)物質(zhì)而受損；ATP減少使得Na-K-ATP酶活性降低，細(xì)胞內(nèi)Na+濃度升高，導(dǎo)致細(xì)胞毒性腦水腫，進(jìn)一步加重?fù)p傷[6-7]。葡萄糖是腦組織代謝的唯一能量來源，是必須依賴GLUT進(jìn)入腦組織的極性分子；提高GLUT表達(dá)可起到神經(jīng)保護(hù)作用，緩解能量代謝衰竭[1]。

圖1 各組不同時間點Micro PET/CT圖

表1 各組大鼠右側(cè)大腦半球VOI 的SUV(±s，n=10)

表1 各組大鼠右側(cè)大腦半球VOI 的SUV(±s，n=10)

注：*：與正常組比較P<0.05；#：與模型組比較P<0.05；▲：與假手術(shù)組比較P<0.05

組別術(shù)后顯像時間(h)26244872F值P值正常組3.96±0.143.92±0.173.89±0.193.99±0.163.99±0.160.71>0.05模型組2.08±0.140.90±0.03*1.23±0.07*1.38±0.07*1.65±0.03*281.54<0.01假手術(shù)組3.93±0.163.99±0.11#3.95±0.15#3.93±0.11#3.91±0.14#0.53>0.05PNS組2.11±0.190.98±0.06*#▲1.43±0.09*#▲1.71±0.04*#▲1.96±0.07*#▲163.02<0.01

圖2 腦組織GLUT-1免疫組織化學(xué)染色(×100) A.正常組； B.模型組； C.假手術(shù)組； D.PNS組

圖3 腦組織GLUT-3免疫組化織化學(xué)染色(×100) A.正常組； B.模型組； C.假手術(shù)組； D.PNS組

表2 各組大鼠腦組織GLUT-1及GLUT-3免疫組織化學(xué)染色平均光密度值

本研究中，術(shù)后6、24、48及72 h，PNS組病灶SUV均高于模型組；隨時間推移，病灶體積逐漸縮小，糖代謝逐漸增高，各時間點SUV差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。模型組及PNS組GLUT-1、GLUT-3表達(dá)較正常組和假手術(shù)組均有所上調(diào)；PNS組平均光密度值高于模型組，提示PNS可提高缺血灶GLUT表達(dá)，進(jìn)而提高糖代謝。

PNS影響腦缺血再損傷后葡萄糖代謝的機(jī)制目前尚未明確。鐘森等[8-10]認(rèn)為PNS上調(diào)GLUT-1/3表達(dá)，有利于葡萄糖轉(zhuǎn)運及提高腦組織中ATP、ADP及AMP含量，從而提高腦組織能量代謝；而CHENG等[11]提出PNS主要通過調(diào)節(jié)三羧酸循環(huán)和氧化呼吸鏈中的關(guān)鍵酶活性而有效抑制乳酸脫氫酶漏出，從而維持線粒體生理功能及正常能量代謝。安冬等[12-13]發(fā)現(xiàn)，PNS除影響腦能量代謝外，還可通過上調(diào)神經(jīng)膠質(zhì)谷氨酸轉(zhuǎn)運體表達(dá)，清除細(xì)胞外、突觸間隙過量谷氨酸而降低微血管通透性，改善微循環(huán)，促進(jìn)血管生成，增加缺血組織血流灌注，調(diào)控凋亡信號通路等機(jī)制，以起到神經(jīng)保護(hù)作用。

本研究通過PNS對18F-FDG攝取的影響評價其對缺血灶葡萄糖代謝率的作用，從而評估其療效。BUNEVICIUS等[14]將18F-FDG攝取與腦葡萄糖代謝率的比值稱為集總常數(shù)，默認(rèn)值為1.0，即默認(rèn)18F-FDG攝取與腦葡萄糖代謝率無差異；集總常數(shù)與物種及缺血時間相關(guān)，理論上同一時間點大鼠的集總常數(shù)是相同的，而腦缺血時大鼠集總常數(shù)增加20%～78%。FUKUMOTO等[15]研究證實18F-FDG攝取增高與腦缺血激活小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及聚集巨噬細(xì)胞相關(guān)。本研究未以相應(yīng)顯像劑排除炎癥反應(yīng)所致18F-FDG攝取增高，但光鏡下觀察病灶區(qū)未見明顯炎性細(xì)胞存在，由此可排除炎癥反應(yīng)對18F-FDG攝取的影響。

綜上，18F-FDG攝取差異可反映大鼠腦葡萄糖代謝的變化趨勢，采用Micro PET/CT可動態(tài)觀察PNS對葡萄糖代謝的影響；PNS可通過上調(diào)腦GLUT-1/3表達(dá)促進(jìn)腦葡萄糖轉(zhuǎn)運，從而緩解能量衰竭，對大鼠腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。