QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜法測定豆芽中4-氯苯氧乙酸鈉

□ 李 碩 歐陽小艷 馬燕娜 覃愛芬 肖 艷 廣電計量檢測（南寧）有限公司

4—氯苯氧乙酸鈉（4—Chlorpheno—xyacetic acid sodium，CPANa），俗稱防落素、保果靈，為白色針狀或棱狀結晶，易溶于水，性質穩定，是一種人工合成的植物生長調節劑[1]，可以促進植物體內的生物合成和生物轉移、促進雙子葉植物下胚軸粗大、減少根部萌發、加速細胞分裂，從而抑制豆類生根，促進果實發育等，因此常被一些不法生產者廣泛用于豆芽生產中[2]。研究表明，4—氯苯氧乙酸鈉對小鼠的肝臟、腎臟以及成熟精細胞具有毒性作用[3]；此外，攝入4—氯苯氧乙酸鈉會導致兒童發育早熟、女性生理發生變化、老年人骨質疏松，甚至引發致癌、致畸等嚴重后果[4—5]。國家質量監督檢驗檢疫總局《關于食品添加劑對羥基苯甲酸丙酯等33 種產品監管工作的公告》（2011 年第156 號公告）對4—氯苯氧乙酸鈉、6—芐基腺嘌呤等33 種產品的食品添加劑注銷生產許可申請。

4—氯苯氧乙酸鈉，經酸化生成4—氯苯氧乙酸（CPA），溶于乙醚、乙腈等有機溶劑，因此，目前的檢測技術主要是通過檢測4—氯苯氧乙酸來間接檢測4—氯苯氧乙酸鈉。4—氯苯氧乙酸的檢測方法有離子色譜法[6—7]、氣相色譜法[8]、薄層層析色譜法[9]、液相色譜法[10—12]以及液質聯用色譜法[13—16]。其中，液質聯用色譜法靈敏度高、定性準確，檢測速度快，且能夠有效排除雜質干擾，是測定4—氯苯氧乙酸殘留的主要方法。其樣品前處理凈化方式主要有固相萃取法、液液萃取法、固相分散法即QuEChERS 法，其中QuEChERS 法主要是利用吸附劑填料與基質中的雜質相互作用，吸附雜質從而達到除雜凈化的目的，具有快速、簡單、價廉、高效、耐用和環境友好等優勢[17]。本文以QuEChERS 法作為主要凈化手段，結合超高效液相色譜—串聯質譜法，建立了一種測定豆芽中4—氯苯氧乙酸鈉的檢測方法。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

日 本 島 津LD—2Z 超 高 效 液 相色 譜 儀； 美 國AB SCIEX Triple QuadTM4500 三重四級桿質譜儀；SUPELCO Discovery? HS C18色譜 柱（5 cm×2.1 mm，3 μm），美國Sigma—aldrich 公司；V2S025 渦旋混合器，德國IKA 公司；LD5—2B 低速離心機，北京京立離心機有限公司。

乙腈、甲醇均為色譜純，購自德國CNW 科技公司；甲酸為色譜純，購自天津市科密歐化學試劑有限公司；無水硫酸鎂、無水乙酸鈉均為分析純，分別購自廣州市金華大化學試劑有限公司、成都金山化學試劑有限公司；4—氯苯氧乙酸鈉（純度XX），購自德國Dr.Ehrenstorfer 公司；N—丙基乙二胺（PSA）、C18粉末（HC—C18，40～60 μm）、石墨化炭黑（Carbon—GCB）均購自上海安譜實驗科技有限公司。

1.2 標準溶液的配制

稱取適量的4—氯苯氧乙酸鈉標準物質，用甲醇溶解成1 mg/mL 的標準儲備液，4 ℃避光貯存，臨用時稀釋。

1.3 樣品前處理

稱取10.00 g（精確至0.01 g）經粉碎均勻的豆芽樣品于50 mL 離心管中，加入20 mL 1%甲酸—乙腈，渦旋混勻2 min；加入5 g 無水硫酸鎂、1.5 g無水乙酸鈉，立即蓋上蓋子上下搖晃，再渦旋混勻2 min，常溫條件下，超聲10 min，5 000 r/min 轉速下離心5 min；準確移取上清液4 mL，轉移到預先裝有0.1 g GCB、0.2 g MgSO4和0.3 g C18的15 mL 離心管中，劇烈振蕩1 min，5 000 r/min 離心5 min，取1 mL 上清液于40 ℃水浴條件下氮吹至近干，用1 mL 含0.1%甲酸的1 ∶1 甲醇水復溶，渦旋混勻，取上清液過0.22 μm 有機微孔濾膜，供UPLC—MS/MS 分析。

1.4 液相色譜-質譜條件

液相色譜條件：柱溫35 ℃，進樣體積10 μL，以含0.1%甲酸的3 mM甲酸銨溶液（A）和乙腈（B）為流動相，梯度洗脫條件如表1 所示。

表1 4-氯苯氧乙酸的液相梯度洗脫條件

質譜條件：電噴霧電離源（ESI），負離子電離模式（ESI—），噴霧電壓5 500 V，離子源溫度500 ℃，采用多反應監測模式（MRM）。碰撞氣和氣簾氣均為氮氣，化合物的監測離子對Q1和Q3（m/z）、去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）、入口電壓（EP）和出口電壓（CXP）等優化的質譜參數見表2，每個離子對的駐留時間均為100 ms。

表2 4-氯苯氧乙酸的質譜參數

2 結果與討論

2.1 前處理方式的選擇

豆芽類樣品含有蛋白質、脂肪、碳水化合物等，基質較為復雜，因此前處理提取和凈化步驟很關鍵。目前的提取溶劑主要有乙腈、乙酸乙酯和乙醚等[15—16]。4—氯苯氧乙酸鈉在酸性條件下以其分子態4—氯苯氧乙酸的形式存在。因此，本文首選酸化乙腈作為提取溶劑。QuEChERS 方法具有快速、簡單、有效的特點，相比于傳統的固相萃取小柱，凈化步驟更為簡單，成本也更加低廉，常用 的QuEChERS 試 劑 有PSA、C18、GCB 等吸附劑，其中PSA 為弱陰離子交換填料，能夠有效去除基質中的糖類、脂肪酸等物質；C18吸附劑是一種硅膠基質鍵合十八烷基填料，具有比表面積大、吸附能力強等優點，可較好地除去脂類等非極性物質的干擾；GCB 具有較強的吸附作用，可以有效去除色素等物質的干擾[18—20]。本文考察了幾組不同成分及配比的QuEChERS 試劑的凈化效果。圖1 可見，經100 mg GCB+200 mg MgSO4+300 mg C18吸附劑組凈化之后的提取液顏色幾乎呈無色，凈化效果最好。此外，還考察了這幾組QuEChERS 試劑對加標回收率的影響，結果見圖2。其中加入PSA 后平均加標回收率在50%左右，回收率偏低，100 mg GCB+200 mg MgSO4+300 mg C18組的平均加標回收率在80%左右，可能是因為PSA 對有機酸、酚類的吸附作用強，在凈化過程中會同時吸附目標化合物，而GCB 和C18的聯合使用，既可以去除脂類等非極性物質的干擾，還可以吸附色素，因此凈化效果更好。

圖1 不同QuEChERS 試劑對提取液凈化效果的比較

圖2 不同QuEChERS 試劑在4-氯苯氧乙酸鈉添加水平為10 μg/kg 時的回收率（n=3）

2.2 復溶試劑的選擇

取凈化之后的上清液氮吹之后，進行檢測分別得到了以甲醇、乙腈、0.1%甲酸水、含0.1%甲酸的1 ∶1 甲醇水為復溶試劑的色譜峰，結果表明以含0.1%甲酸的1 ∶1 甲醇水為復溶試劑，其目標物色譜峰型良好，響應強度較高，加入酸可以改善峰形，加入甲醇可以促進目標物的溶解，色譜圖見圖3。

圖3 不同試劑復溶之后的色譜圖

2.3 方法線性、檢出限及定量限

對一定濃度范圍的標準溶液，在選定的色譜和質譜條件下進行測定，以峰面積與標準溶液中被測組分4—氯苯氧乙酸鈉的濃度為縱橫坐標做圖，結果表明，在濃度為1 ～500 ng/mL范圍內呈良好的線性關系，相關系數（R2）為0.999 8。根據殘留檢測要求，按3 倍信噪比計算方法的檢出限，按10 倍信噪比計算方法的定量限，本方法的檢出限LOD 和定量限LOQ 見表3。

表3 4-氯苯氧乙酸鈉的線性方程、相關系數、方法檢出限和定量限

2.4 方法準確度、精密度和實際樣品檢測

在陰性樣品中進行添加回收實驗，采用本方法分別在綠豆芽和黃豆芽樣品中，添加10、50、100 μg/kg 低、中、高水平的4—氯苯氧乙酸鈉，每個添加水平做6 個平行試驗，用于考察該方法的準確度和精密度。結果表明，在綠豆芽基質中，平均加標回收率在78.2%～86.3%，相對標準偏差在3.8%～4.3%；在黃豆芽基質中，平均加標回收率在76.4%～82.4%，相對標準偏差在4.0% ～5.4%（見表4），說明該方法的回收率和精密度良好。采用本方法檢測隨機抽取的30 個樣品，其中有3 個樣品為陽性，其4—氯苯氧乙酸含量分別為32.7、76.5、96.1 μg/kg。

表4 4-氯苯氧乙酸鈉的平均加標回收率及相對標準偏差（n=6）

3 結論

本文以QuEChERS 法作為主要凈化手段，結合超高效液相色譜—串聯質譜法，建立了一種測定豆芽中4—氯苯氧乙酸鈉的分析方法。該方法簡單易操作，凈化效果好，定量準確，靈敏度高，檢測限低至0.25 μg/kg，可以滿足相關標準對豆芽中4—氯苯氧乙酸鈉殘留分析的檢測要求。