真菌性角膜炎基因表達的臨床研究

王 旭，王巧玲，張玉光*，張晨明，黨 惠，位 寧，丁 剛，高 芯

（濟南市第二人民醫院眼科，山東 濟南 250012）

真菌性角膜炎（Fungal Keratitis，FK）是我國角膜病致盲的重要病因， 而且發病率逐年上升[1]。在世界范圍內也是致盲率很高的感染性眼病，發病率也在逐漸增加，因此，對該病的早期診斷，早期治療至關重要，減少誤診，避免造成嚴重后果，現報告如下：

1 樣本和方法

樣本分析：

（1）人角膜組織樣本

20份人角膜組織樣本均來自濟南市第二人民醫院眼六科，10例為正常角膜組織、10Loi為真菌性角膜炎角膜組織，所選取樣本流程、操作均與我國醫學倫理會委員制度要求相符，其中真菌性角膜炎角膜組織取材于真菌性角膜炎角膜移植切除術后組織，10例患者術前裂隙燈檢查顯示角膜潰瘍面積均大于5×5 mm，有不同程度的前房積膿，需要行穿透性角膜移植手術治療，術前均進行菌絲涂片檢查，顯示7眼為鐮刀菌感染，3眼為曲霉菌感染[2]。正常角膜組織取材于10例供體角膜術后剩余組織。

（2）角膜組織樣本的取材

手術中切下病變組織后，切取其3/4部分在十分鐘內放入-80℃深低溫保存待檢，剩余1/4部分送病理檢查，由2位病理科醫生分別進行病理診斷以確定臨床診斷及標本的可用性。選取十個新鮮人角膜，用環鉆鉆取中央透明角膜用于臨床移植（直徑＜7 mm），然后延角膜緣灰線剪下透明角膜組織，迅速放入-80℃深低溫保存待檢。

2 信息分析流程

2.1 進行常規流程的信息分析

對項目信息數據的計算，使用線性模型校驗P-value是否存在顯著差異，另外對所得檢驗值再使用Benjamini-Hochberg法加以校正（FDR）。基因符合顯著性差異判定的依據是：|Fold Change|＞3同時FDR＜0.05。另外，對兩樣本組中，處于所有探針組信號強度排序的最低20%范圍內的探針組，視為背景噪音，篩選并濾除[3]。之后，使用變異系數法，對相同探針組于同一樣本組中的變異系數（Eq 1-2）進行計算，對所得值＞25%的探針組濾除。經上述預處理之后，剩余探針數量具體統計數據如表1所示。

2.2 微陣列數據采集和預處理

基因表達譜：在E-GEOD-58291的微陣列數據中，有10個角膜炎樣本和10個正常樣本。經過數據預處理，我們最終獲得了含有1714個基因的基因表達矩陣，709個上調基因，1005個下調基因。基于KEGG通路數據庫進行基因表達矩陣的途徑富集分析[4]。我們將基因表達數據與KEGG調控途徑合并，并選擇了基因重疊大于10的26條差異顯著途徑。

表1 數據過濾前后探針（組）統計

2.3 Hub基因鑒定

Hub基因被稱作樞紐基因或中樞基因，與某些臨床特征高度相關的基因，分析差異途徑中的基因以發現通路基因集合，并對它們在差異途徑中的頻率進行計數。 隨后，將通路基因組轉換成MC，然后進行吉布斯取樣。最后選擇皮爾遜相關性絕對值（cor.genemodembership）＞0.8和臨床特質關系（Pearson's correlation，cor.genetraitsignificant）＞0.2的差異途徑基因作為樞紐基因。

3 結 果

為了獲得與真菌性角膜炎相關的潛在Hub基因，吉布斯采樣被重新利用以計算途徑基因組的概率。基于adj_αPI＞0.8鑒定了10個基因座基因，包括KRT16（角蛋白16），MMP9，DEFB4A，MMP1，IL36G，GEM，TAC1，ANGPT1，EDN3C7。它們在正常和真菌性角膜炎狀態下的基因表達譜顯示，與正常組相比，KRT16，MMP9，DEFB4A，MMP1，IL36G在真菌性角膜炎組中顯著增強（P＜0.05），GEM，TAC1，ANGPT1，EDN3，C7在真菌性角膜炎組中顯著減弱。

4 討 論

采取通路分析這一途徑，能更為直接、全面且系統性的了解到細胞生物學過程、疾病發生機理和藥物作用發揮機制等內容。大多數I型細胞角蛋白由酸性蛋白組成，它們排列成成對的異型角蛋白鏈，聚集在17q12-q21染色體的區域。DEFB4A（defensin beta 4A，防御素β-4A）表達上調：防御素是由嗜中性粒細胞產生的殺微生物和細胞毒性肽家族[5]。

綜上所述，本研究基于生物信息學方法發現了與真菌性角膜炎相關的幾個關鍵途徑，因此，監測這些信號通路可能有助于預測或治療真菌性角膜炎的發生和發展。真菌性角膜炎中的Hub基因，即KRT16，MMP9，DEFB4A，MMP1，IL36G，GEM，TAC1，ANGPT1，EDN3及C7基因是基于使用吉布斯采樣的途徑基因集確定的。這個結果有可能是我們未來作為真菌性角膜炎的診斷標準，而且以此為依據，可以為以后真菌性角膜炎的藥物治療或者抗真菌藥物的研發提供有意義的指導。