熊去氧膽酸小檗紅堿酯的制備

龍碩，劉珍寶，彭東明，劉曉欽，蔣婷，劉艷飛

（1.中南大學化學化工學院，湖南長沙，410083；2.中南大學湘雅藥學院，湖南長沙，410013；3.湖南中醫藥大學藥學院，湖南長沙，410208）

小檗堿（berberine，BBR）是天然藥物黃連中的主要有效成分，故又稱為黃連素。小檗堿化學結構是一類含喹嗪的生物季銨堿[1-2]。研究表明小檗堿作為一類天然產物，毒副作用小，具有降血脂[3]、降血糖[4]、抗菌[5]、抗腫瘤[6]等藥理作用。小檗堿由于其溶解性和滲透性差，在體內不容易被吸收，生物利用度低，因此，對小檗堿進行結構修飾成為了研究熱點[7]。目前，對小檗堿的結構修飾主要集中在其異喹啉環的N（7），C（8），C（9），C（12）和C（13）這5個位置單位點或者雙位點改造。BIAN等[8]將小檗堿芳香族季氮還原為叔氮，然后烷基化生成N-烷基衍生物，再氧化生成N-氧化物，并探究了體外的降糖活性。YANG 等[9]以小檗堿為原料，以環小檗堿為先導化合物合成了一系列新的8-取代環小檗堿衍生物，研究發現其對革蘭氏陽性病菌的抗菌活性比小檗堿的強。LIU 等[10-11]合成了一系列新的9-O 取代小檗堿衍生物，并對其抗炎活性進行了評價，與小檗堿相比，布洛芬和萘丙嗪修飾的小檗堿衍生物具有增強抗炎活性的作用。ENKHTAIVAN等[12]在小檗紅堿C（12）上連接哌嗪類分子，合成了哌嗪類小檗堿衍生物，并發現小檗堿衍生物的抗流感活性較小檗堿的強，其中，對氟苯基取代的哌嗪小檗堿抗流感活性較對照藥物奧司他韋強。PARK等[13]通過在小檗堿和小檗紅堿的13-C中引入不同的芳香基團，合成了一系列13-取代芐基的小檗堿和小檗紅堿衍生物，并對其抗真菌活性進行了研究，研究發現合成的化合物具有比小檗堿和小檗紅堿更強的抗真菌活性。鑒于此，基于小檗堿藥物功能需求，各類不同藥理活性的修飾基團或化合物被設計并連接于小檗堿各個位點，為小檗堿衍生物合成提供了實驗基礎。熊去氧膽酸（ursodeoxycholic acid，UDCA）最初由北極熊膽內提取出來，作為一種次級膽酸[14]，其結構中包含甾體母體及羥基、羧基雙官能團。傳統中藥中熊膽曾被用來清除毒素、治療肝疾和眼疾[15]?，F階段研究報道UDCA 具有溶解膽固醇結石[16]，有利于治療膽汁淤積性肝功能疾病，并顯著降低膽汁中膽固醇飽和度的優良藥物性能[17]。在藥理學方面，因為它具有很好的療效且沒有毒副作用，被認為是很好的治療膽結石的藥物[18]。因此，UDCA 在臨床上主要用于治療高血脂和肝膽疾病[19]。本文作者擬以熊去氧膽酸修飾9-O 小檗堿，期望2種具有降脂功能的藥物能在體內發揮出協同作用，并通過引入熊去氧膽酸，改善小檗堿酯油水分配系數以提高生物利用度，增強降脂活性。通過直接偶聯實驗發現，小檗紅堿修飾位點酚羥基酯化活性較低，且空間位阻大，難以與熊去氧膽酸直接酯化連接，故采用橋連[20]的方法修飾小檗堿。

1 實驗

1.1 樣品與試劑

樣品有小檗堿（湖南湘泉制藥有限公司生產）和熊去氧膽酸（湖南云港生物科技有限公司生產），其他試劑和溶劑均為分析純。

1.2 小檗紅堿的制備

稱取10.0 g（0.028 mol）小檗堿，在溫度為190 ℃、壓力為2.67 kPa 真空干燥箱中反應0.5 h，小檗堿黃色粉末完全變為暗紅色固體。將小檗堿黃色粉末冷卻至室溫，將其用中性氧化鋁柱（流動相用乙醇與二氯甲烷體積比（V（乙醇）：V（二氯甲烷））為1：9）進行分離，濃縮收集液，于35 ℃旋轉蒸發，得到暗紅色純品化合物Ⅰ小檗紅堿，產率為94.6%。

1.3 直接酯化法制備熊去氧膽酸小檗紅堿酯

稱取0.50 g（1.56 mmol）小檗紅堿置于50 mL圓底燒瓶中，加入20 mL 除水CH3CN，超聲使其充分溶解，然后在體系中加入0.095 g （0.78 mmol）4-二甲氨基吡啶（DMAP）和0.61 g（1.56 mmol）熊去氧膽酸，在恒溫磁力攪拌器上攪拌5 min 后加入0.15 g （0.78 mmol）1-乙基-（3-二甲基氨基丙基碳二亞胺鹽酸鹽）（EDCI），在25 ℃下攪拌反應12 h，利用薄層色譜（TLC）（V（乙醇）：V（二氯甲烷）=1：10 為流動相）監測反應。

1.4 熊去氧膽酸-β-溴乙酯的制備

稱取1.0 g（2.55 mmol）熊去氧膽酸白色粉末置于50 mL圓底燒瓶中，將其溶于10 mL二甲基甲酰胺（DMF）溶液并在體系中滴加3 mL 1，2-二溴乙烷，在不斷攪拌下加入1.4 g K2CO3。對反應體系在常溫（25 ℃）下攪拌，利用TLC（V（乙酸乙酯）：V（石油醚）=2：1，為流動相）監測，4 h反應完全。過濾除去反應液中K2CO3固體，加入20 mL 氯仿萃取3次，收集合并萃取液，先后用50 mL飽和NaHCO3溶液、50 mL 飽和NaCl 溶液洗滌，洗滌后加入適量無水MgSO4干燥24 h。于30 ℃旋蒸濃縮反應液，以硅膠為固定相，V（乙酸乙酯）：V（石油醚）=1：1為流動相進行柱層析分離，收集合并分離液，蒸干溶劑得白色粉末狀固體，得目標化合物Ⅱ，產率為73.1%。

1.5 熊去氧膽酸-（9-O-乙基）-小檗紅堿酯的合成

稱取0.50 g（1.4 mmol）化合物Ⅰ，0.75 g（1.5 mmol）化合物Ⅱ以及0.025 g KI（0.15 mmol）于50 mL 圓底燒瓶，加入10 mL DMF 使其充分溶解，體系在60 ℃下攪拌反應10 h，利用TLC監測，反應完全。冷卻至室溫，滴加乙醚至析出晶體，將其抽濾，濾餅于35 ℃真空干燥12 h，得到粗品黃色固體。粗產品以中性氧化鋁柱為固定相，V（乙醇）：V（二氯甲烷）=1：10為流動相進行柱層析分離得暗黃色最終產物目標化合物，產率為72.5%。

2 實驗結果與討論

2.1 熊去氧膽酸小檗紅堿酯合成

熊去氧膽酸小檗紅堿酯的直接偶聯法合成路線見圖1。

通過對反應條件的多次探究，發現小檗紅堿與熊去氧膽酸難以直接酯化，分析其原因可能是：一方面，熊去氧膽酸是一類天然有機弱酸，作為酯化反應中心的羧基表現出較低的反應活性；另一方面，小檗紅堿中羥基為酚羥基，受苯環共軛效應與臨位甲氧基空間位阻的影響，難以同熊去氧膽酸酯化縮合。而橋連法能有效解決分子間因空間位阻較大而難以偶聯的難點，因此，將熊去氧膽酸小檗紅堿酯的合成策略改變為橋連合成法。

熊去氧膽酸小檗紅堿酯的橋連法合成路線見圖2。

圖1 化合物L1的合成路線Fig.1 Synthesis route of compound L1

圖2 化合物L2的合成路線Fig.2 Synthesis route of compound L2

對所合成的化合物使用Bruker Avance III 400 MHz 核磁儀進行氫譜和碳譜表征，使用Bruker compact Q-TOF質譜儀進行質譜表征。

中間體熊去氧膽酸-β-溴乙酯的核磁共振氫譜圖如圖3所示。其1H NMR（400 MHz，CDCl3）表征數據為：化學位移δ 4.38（t， J=6.1 Hz， 2H），3.58 （dd，J=10.3， 5.5 Hz， 2H），3.51 （t， J=6.1 Hz，2H），2.40（ddd， J=15.1， 9.9， 5.1 Hz， 2H），2.34～2.20 （m， 2H），0.95（s，6H），0.68（s，3H）（其中，s指單峰，d指雙重峰，t指三重峰，m指多重峰，dd指雙二重峰，ddd指對稱的2 個dd 峰）。由圖3 可以看出：在接入溴乙基之后，在化學位移4.38和3.58處出現2組三重峰，為溴乙基上乙基的峰，表示小檗紅堿酯成功與熊去氧膽酸相連接，而由于溴乙基的影響，熊去氧膽酸環上面氫的化學位移都產生微小變化。

圖3 熊去氧膽酸-β-溴乙酯的核磁共振氫譜圖Fig.31H NMR spectrum of ursodeoxycholic acid-βbromoethyl ester

目標化合物熊去氧膽酸小檗紅堿酯的核磁共振氫譜如圖4所示。其1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）表征數據為：化學位移δ 9.85 （s， 1H），8.99（s， 1H），8.22 （d， J=9.1 Hz， 1H），8.02 （d， J=9.1 Hz，1H），7.81（s，1H），7.10（s，1H），6.18（s，2H），4.95（t， J=5.9 Hz， 2H），4.54 （d， J=4.2 Hz， 2H），4.47（t， J=3.4 Hz， 2H），4.07 （s， 3H），0.86 （s， 6H），0.54（s，3H）。由圖4 可知：在化學位移6~8 之間出現多組峰；對應的是小檗堿母體苯環上氫的峰；化學位移4.95 和4.47 對應的是溴乙基的峰；化學位移0.5~2.5之間對應的是熊去氧膽酸母體的峰。

圖4 化合物L2的核磁共振氫譜圖Fig.41H NMR spectrum of compound L2

目標化合物熊去氧膽酸小檗紅堿酯的核磁共振碳譜如圖5所示。其13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）表征數據為：化學位移173.7，150.6，150.4，148.3， 145.8， 143.0， 138.0， 133.5， 131.1，127.2， 124.1， 122.1， 120.9， 120.8， 108.9，105.9， 102.6， 72.3， 70.2， 70.0， 64.0， 57.6，56.2，55.1，43.6，43.5，42.6，39.1，38.2，37.7，36.3，35.3，34.2，31.3，31.1，30.7，28.6，27.1，26.9，23.8，21.3，18.7，12.5，12.4。碳譜表征結果與化合物小檗紅堿熊去氧膽酸酯分子式的結構特征相符。

圖5 化合物L2的核磁共振碳譜圖Fig.513C NMR spectrum of compound L2

熊去氧膽酸小檗紅堿酯的質譜如圖6所示。經數據分析可知：其分子離子峰質荷比（m/z）為740.451 1，這與[C45H58NO8+]的質荷比預測值740.42相吻合，確定為目標化合物。

2.2 反應條件優化

在酯化反應中，將熊去氧膽酸與二溴乙烷反應制備出熊去氧膽酸-β-溴乙酯，該步反應所優化條件與產率見表1。

圖6 化合物L2的質譜圖Fig.6 Mass spectrum of compound L2

表1 酯化反應合成條件Table 1 Synthesis conditions of ester formation reaction

首先對反應溫度進行考察。由表1可知：在溫度為20~40 ℃時，溫度與產率的關系呈現出近似拋物線關系；25 ℃時，產率最高，達73.1%。造成這種趨勢的原因在于在堿性環境中，較低溫度無法提供反應所需達到能壘的能量，從而使得產率稍低；隨著溫度提升，鹵代烴發生消除反應的趨勢增大，故產率又有所下降，但因為縛酸劑K2CO3作為固相與整個液相體系分離，堿性較低使得下降程度并不十分明顯。而TLC 顯示，反應從1 h開始便有產物點生成，4 h后反應結束，延長反應時間對產率無明顯提升。

選擇DMF、乙酸乙酯（EA）和乙醇（EtOH）為溶劑，發現熊去氧膽酸能很好地溶于DMF 與EtOH，在EA中溶解度較低，以DMF為溶劑時產率最高，達73.1%，而在EA 中反應產率稍有降低，這可能是反應底物在該溶劑中的溶解度下降所致。雖然底物能很好地溶于EtOH，但產率驟減至17.2%，其原因可能是：作為溶劑的乙醇同時也是該步親核取代反應的競爭物質，從而導致反應不充分，副產物主要為乙基-β-溴乙基醚?？紤]到該步反應將產生游離HBr，需要加入適量縛酸劑以促進反應正向進行，根據已有研究，首先選擇最為常見的K2CO3作為縛酸劑；隨后，考慮到K2CO3的加入使得反應體系為非均相反應，又選擇常用的有機縛酸劑吡啶進行研究。結果表明：作為縛酸劑，吡啶的效果略微優于K2CO3的效果，產率達到74.7%，雖然以K2CO3為縛酸劑的產率（73.1%）略低于吡啶為縛酸劑的產率，但考慮到后續處理簡便以及試劑的毒性，選擇K2CO3為最優縛酸劑。

制備得到熊去氧膽酸-β-溴乙酯后，將其與小檗紅堿進行親核取代反應，并對該步反應中的反應溫度、反應時間、溶劑種類、催化劑種類及用量進行條件優化，結果見表2。

由表2可見：隨著溫度升高，醚化反應產率與溫度呈拋物線關系，最優溫度為60 ℃。當催化劑用量為0.10 時，產率為72.5%；當催化劑用量為0.15時，產率為72.6%。經綜合考慮，最優條件選用催化劑用量為0.10。結合酯化反應最高產率為73.1%，所得熊去氧膽酸小檗紅堿酯的總收率為53.0%。

表2 醚化反應合成條件Table 2 Synthesis conditions of ether forming reaction

在反應過程中，酯化反應時間為4 h，而醚化反應需10 h 完成，這也進一步說明在小檗紅堿與熊去氧膽酸的縮合連接中，小檗紅堿是整個反應的關鍵，需解決其羥基活性不足、所受空間位阻較大的問題。

在溶劑的選擇上，已驗證EtOH作為溶劑對反應體系的消極影響，改用非質子溶劑四氫呋喃（THF）。結果表明，DMF 仍是最優的溶劑。最后，考慮到該步反應引入了連接點周圍空間位阻較大的小檗堿，選擇鹵酸鹽進行催化反應，并對催化劑的種類與用量進行篩選，發現當不使用任何催化劑時，該步反應產率僅有53.6%，而KI 對該步反應有明顯的催化效果，使得產率增加至72.5%。KCl 對反應幾乎沒有催化作用，產率為56.8%。反常的是，KBr的加入使得反應產率較不添加催化劑時更低，產率僅為39.2%，其原因在于溴化鉀的同離子效應使得熊去氧膽酸-β-溴乙酯中的溴元素去除難度增加，從而對反應產生了抑制作用。

3 結論

1）以小檗堿和熊去氧膽酸為原料，通過小檗堿9-O 位酯化，制備了新型化合物熊去氧膽酸-（9-O-乙基）-小檗紅堿酯，并經氫譜、碳譜和質譜確證了化合物結構。

2）以1，2-二溴乙烷為橋連試劑，克服了小檗堿和熊去氧膽酸連接位點空間位阻過大且反應活性較低等問題，成功得到目標化合物。此合成工藝簡單，條件溫和，得到的產物穩定，收率高達53.0%。

3）基于藥物的協同作用，該熊去氧膽酸修飾的小檗堿衍生物可望成為一種優良的降脂藥物用于臨床。