白芍總苷輔助治療兒童紫癜性腎炎的療效及其機制探討：前瞻性隨機對照研究

邵寬芙蓉 關鳳軍 董晨

（徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院兒科，江蘇徐州 221000）

過敏性紫癜（Henoch-Sch?nlein purpura, HSP）屬于自身免疫反應所介導的全身性血管炎，HSP患者中有30%～50%累及腎臟，出現(xiàn)血尿、蛋白尿[1]，稱為紫癜性腎炎（Henoch-Sch?nlein purpura nephritis, HSPN），多發(fā)生于起病1 個月內。該病容易復發(fā)[2],預后取決于腎臟受累程度。本病發(fā)病機制尚未完全明確，已有研究證明Th1/Th2、Th17/Treg 細胞失衡在HSP 發(fā)病機制中占有重要作用[3-4]。而近期發(fā)現(xiàn)了一種不同于Th1、Th2 細胞的CD4+T細胞亞群[5]，稱為濾泡輔助性T（follicular helper T,Tfh）細胞，具有輔助B 細胞活化成熟的功能[6]，同時表達PD-1、CXCR5、ICOS 等表面分子[7]，通過產生IL-21、IL-4 刺激B 細胞分化并促進抗體類別轉換。目前越來越多的證據(jù)支持Tfh 細胞在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、Graves 病等各種自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要作用[8]。有研究表明[9]，Tfh 細胞參與了兒童HSP 的發(fā)病，且與HSPN 的腎臟損害存在一定聯(lián)系。

HSPN 持續(xù)的蛋白尿可導致腎小管間質損害，α1 微球蛋白（A1M）是相對分子質量為30 000 的糖蛋白，特異性好，僅在腎小管損傷時排出明顯增加[10]。血清胱抑素C（CysC）作為一種分泌性蛋白，產生率相對恒定，通過腎小球濾過排泄，之后被近曲小管重吸收并迅速分解代謝，不再重回血液循環(huán)，因此CysC 常被用于評估腎功能。

CysC 和A1M 可作為判斷腎臟損害程度的指標[11]，聯(lián)合檢測兩者能更好地判斷腎臟損害程度。對于HSPN 患兒，目前主要是通過藥物，如糖皮質激素、免疫抑制劑等進行治療，但其副作用較大，療效欠佳。白芍總苷（total glucoside of paeony,TGP）作為一種中成藥制劑，通過調節(jié)自身免疫疾病患者的細胞免疫、體液免疫及炎癥過程，起到抑制和調節(jié)免疫反應、抗炎等作用[12]。近年來，在應用TGP 治療HSPN 時取得了較好的臨床療效和較高的用藥安全性[13]，但其確切的作用機制尚未明確。因此探討TGP 治療HSPN 的臨床療效及對Tfh 細胞、IL-21、IL-4 表達的影響，為今后TGP 更好地應用于臨床提供一定的理論依據(jù)，為兒童HSPN 的治療及對腎臟損害的改善提供新思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2019 年1 月至2020 年1 月在徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院就診的中度蛋白尿型HSPN 患兒共64 例作為研究對象。納入標準：（1）初發(fā)病例；（2）診斷均符合中華醫(yī)學會兒科學分會腎臟學組制定的《紫癜性腎炎診治循證指南（2016）》[14]；（3） 伴有中度蛋白尿[24 h 尿蛋白定量為25～50 mg/(kg·d)]，無血尿；（4）近2 周未使用過糖皮質激素、環(huán)磷酰胺等影響免疫功能的藥物；（5）既往無腎臟疾病、變態(tài)反應性疾病或自身免疫性疾病等相關病史。排除標準：（1）年齡＜3歲或年齡＞12 歲者；（2）有嚴重肝腎功能障礙者；（3）有明確對本試驗中使用藥物成分有禁忌者。通過預調查及樣本量估算公式，計算得出每組需納入27 例。采用隨機數(shù)字表法將64 例患兒分成TGP 治療組（TGP 組，n=34）和常規(guī)治療組（常規(guī)組，n=30）；另選取同期于我院門診行健康體檢兒童30 例作為健康對照組，既往無腎臟及自身免疫性疾病史。所有入組兒童家長均已簽署知情同意書，本研究已獲本院醫(yī)學倫理委員會批準（XYFY2019-KL062-01）。

1.2 方法

HSPN 兩組患兒入院后，予常規(guī)治療。在此基礎上TGP 組加用TGP 膠囊（寧波立華制藥有限公司，國藥準字H20055060，規(guī)格：0.3 g/粒），用量：30 mg/(kg·d)，分2 次口服，最大劑量不超過1.8 g/d，口服4 周。

1.3 監(jiān)測指標

清晨采集健康對照組兒童空腹肘靜脈血，以及HSPN 兩組患兒在治療前及治療4 周后空腹肘靜脈血約4 mL 置于肝素抗凝試管中，并將其分為Ⅰ、Ⅱ兩管（各2 mL）。Ⅰ管離心后（3 000 r/min，10 min）留取血漿，采用ELISA 抗體夾心法檢測血漿中IL-21、IL-4 的濃度，試劑盒購自康美生物科技有限公司，操作步驟遵循試劑盒說明書。Ⅱ管加入抗CD4（FITC）和抗PD-1（PE）抗體；再加入混勻的50 μL 待測樣品，混勻后室溫避光孵育30 min；用紅細胞裂解液，37℃水溶約10 min，待完全溶血后，BSB 洗1 次，定義CD4+PD-1+細胞群為Tfh 細胞群，流式細胞術分析外周血CD4+PD-1+Tfh 細胞占CD4+T 細胞比例。采用乳膠增強免疫比濁法檢測患兒血清中CysC 水平，采用放射免疫分析法測定尿A1M 水平。以上由徐州醫(yī)科大學檢驗中心完成。

1.4 療效判斷

根據(jù)參考文獻[15]進行療效判定。痊愈：紫癜、腹痛等全身癥狀與體征消失，實驗室指標恢復正常；顯效：全身癥狀與體征較前明顯減輕，實驗室指標較前有所改善；無效：全身癥狀、體征及實驗室指標均無變化或惡化。治療總有效率=（痊愈例數(shù)+顯效例數(shù)）/總例數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 24.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。計量資料使用均數(shù)±標準差（x±s）表示，同組治療前后比較采用配對樣本t檢驗，兩組間數(shù)據(jù)比較采用兩樣本t檢驗，相關性分析采用Pearson 相關分析。計數(shù)資料采用百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般臨床資料

HSPN 組與健康對照組、常規(guī)組與TGP 組在年齡、性別方面比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1～2。

2.2 HSPN 組與健康對照組外周血中Tfh 細胞及IL-21、IL-4 水平測定

HSPN 患兒治療前Tfh 細胞比例及血漿IL-21、IL-4 細胞因子表達水平均較健康對照組明顯升高（P＜0.01），見表3 及圖1。

表1 HSPN 組與健康對照組一般臨床資料的比較

表2 常規(guī)組與TGP 組一般臨床資料的比較

表3 健康對照組與HSPN 組治療前Tfh 細胞比例及IL-21、IL-4 水平比較 （±s,）

表3 健康對照組與HSPN 組治療前Tfh 細胞比例及IL-21、IL-4 水平比較 （±s,）

組別 例數(shù) Tfh 細胞比例(%)IL-21(pg/mL)IL-4(pg/mL)健康對照組 30 24.53±0.22 131±5 19.5±1.6 HSPN 組 64 32.01±0.27 250±6 40.6±1.5 t 值 -133.543 -96.492 -63.595 P 值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

圖1 健康兒童與HSPN 患兒治療前外周血Tfh 細胞占CD4+T 細胞的比例 Q2 象限示Tfh 細胞比例。

2.3 相關性分析

HSPN 患兒治療前外周血中Tfh 細胞比例與IL-21 水平呈顯著正相關（r=0.766，P＜0.0001）。同時，治療前血漿中IL-4 水平與Tfh 細胞比例及與IL-21 水平亦呈正相關（分別r=0.437、0.401，P＜0.01），見圖2。

圖2 HSPN 患兒治療前Tfh 細胞比例及IL-21、IL-4 水平相關性分析圖

2.4 臨床療效及不良反應比較

兩組患兒治療結束后，TGP 組的總有效率明顯高于常規(guī)組（P＜0.05，表4）。兩組患兒在治療期間均未發(fā)生嚴重藥物不良反應；治療期間血常規(guī)、肝腎功能等檢查均未發(fā)現(xiàn)明顯異常。

表4 兩組患兒臨床療效 [例（%）]

2.5 兩組患兒治療前后Tfh 細胞比例及IL-21、IL-4 水平變化

兩組患兒經過治療后，Tfh 細胞比例及IL-21、IL-4 水平均較治療前顯著下降（P＜0.01）。治療后的TGP 組患兒外周血Tfh 細胞比例及IL-21、IL-4 水平均顯著低于常規(guī)組（P＜0.01）。見圖3 及表5。

2.6 兩組患兒治療前后血清CysC 及尿A1M 水平變化

兩組患兒經過治療后血清CysC 及尿A1M 水平均較治療前明顯下降（P＜0.01），而TGP 組患兒較常規(guī)組下降更為顯著（P＜0.01），見表6。

圖3 常規(guī)組與TGP 組患兒治療4 周后外周血Tfh 細胞占CD4+T 細胞的比例 Q2 象限示Tfh 細胞比例。

表5 兩組患兒治療前后Tfh 細胞比例及IL-21、IL-4 水平比較 （±s,）

表5 兩組患兒治療前后Tfh 細胞比例及IL-21、IL-4 水平比較 （±s,）

組別 例數(shù) Tfh 細胞比例(%) IL-21 (pg/mL)治療前 治療后 t 值 P 值 治療前 治療后 t 值 P 值常規(guī)組 30 32.03±0.28 27.64±0.29 84.365 ＜0.01 249±5 184±6 69.057 ＜0.01 TGP 組 34 31.99±0.25 26.05±0.26 185.345 ＜0.01 251±6 154±3 134.974 ＜0.01 t 值 -0.612 -22.876 1.253 -24.983 P 值 0.543 ＜0.01 0.215 ＜0.01組別 例數(shù) IL-4 (pg/mL)治療前 治療后 t 值 P 值常規(guī)組 30 40.8±1.4 33.8±0.8 27.754 ＜0.01 TGP 組 34 40.4±1.5 26.6±1.1 54.215 ＜0.01 t 值 -0.950 -29.445 P 值 0.346 ＜0.01

表6 兩組患兒治療前后血清CysC 及尿A1M 水平比較 （±s,）

表6 兩組患兒治療前后血清CysC 及尿A1M 水平比較 （±s,）

注：[CysC] 胱抑素C；[A1M] α1 微球蛋白。

組別 例數(shù) CysC (mg/L) A1M (μg/mL)治療前 治療后 t 值 P 值 治療前 治療后 t 值 P 值常規(guī)組 30 0.77±0.13 0.58±0.07 13.304 ＜0.01 12.7±2.4 9.5±1.6 14.774 ＜0.01 TGP 組 34 0.74±0.09 0.42±0.06 26.744 ＜0.01 12.0±1.1 6.6±1.2 34.481 ＜0.01 t 值 -1.151 -9.349 -1.329 -8.224 P 值 0.254 ＜0.01 0.192 ＜0.01

3 討論

HSP 是一種自身免疫性血管炎，其發(fā)病機制尚未完全闡明。HSP 病變累及腎臟時會發(fā)展為HSPN，甚至發(fā)展為終末期腎病，是本病最嚴重的合并癥之一，故腎臟受累的嚴重程度是決定患者預后的關鍵性因素。有研究表明Tfh 細胞是抗體產生的真正輔助者，與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關[16]。Tfh 細胞異常表達可能是導致急性期HSP體液免疫功能紊亂的原因之一。Tfh 細胞主要通過分泌IL-21、IL-4 發(fā)揮抗炎作用。IL-21 是Tfh 細胞執(zhí)行效應功能的主要細胞因子[17-18]，通過產生IL-21 等細胞因子及表達ICOS 等協(xié)同刺激分子促進生發(fā)中心的形成、B 細胞的增殖分化及免疫球蛋白類別轉化[19]。IL-4 是機體免疫反應中重要的細胞因子，可促進活化B 細胞的增殖，并促進B 細胞產生IgG1、IgE 和sIgM，調節(jié)B 細胞和單核細胞表達IgE Fc 受體，參與變態(tài)反應性疾病的發(fā)病過程。本研究顯示，HSPN 患兒外周血Tfh 細胞比例及IL-21 表達水平均較健康對照組明顯升高，同時顯示，Tfh 細胞比例與IL-21 水平呈正相關，與國內外的報告相一致[20-21]，說明Tfh 細胞及其執(zhí)行效應功能的細胞因子IL-21 共同參與了HSPN 的發(fā)生、發(fā)展，但其具體的作用機制還需進一步的探討研究。且本研究發(fā)現(xiàn)HSPN 患兒IL-4 水平高于健康對照組，IL-4 與Tfh 細胞比例及IL-21 水平亦呈正相關關系，由此猜測IL-4 也參與了HSPN 的發(fā)病過程，并且與Tfh 細胞、IL-21 關系密切。

TGP 是從中藥白芍中提取的有效成分，是一種免疫調節(jié)劑，可抑制T 淋巴細胞的活化，調節(jié)Th1/Th2 細胞亞群平衡，抑制炎癥介質的合成及釋放，誘導調節(jié)性T 細胞的生成，下調炎性因子的表達水平，發(fā)揮抗炎作用。有研究表明，TGP 不僅可以起到增強HSPN 療效的作用，還可以有效緩解其他藥物在治療HSPN 時可能對肝、腎功能產生的損害[22]。本研究通過對TGP 治療中度蛋白尿型HSPN 臨床療效的觀察，發(fā)現(xiàn)TGP 組總有效率明顯高于常規(guī)組，且無嚴重不良反應。同時，經過治療后兩組患兒的Tfh 細胞比例及IL-21、IL-4水平均較前下降，而TGP 組患兒的Tfh 細胞比例及IL-21、IL-4 表達水平較常規(guī)組顯著下降。因此，通過下調Tfh 細胞比例從而抑制IL-21、IL-4 等炎癥因子的合成及釋放，抑制機體炎癥反應，可能是TGP 治療HSPN 發(fā)揮作用的主要機制之一。

目前臨床上多通過檢測患者體內的尿素氮和血肌酐對腎功能損害程度進行評價，但易受多種因素的影響，因此診斷效能并不高。血清CysC為半胱氨酸抑制劑家族中的一員，僅通過腎小球濾過，與尿素氮、血肌酐、尿肌酐等指標相比，CysC 不受炎癥、發(fā)熱、免疫等疾病的影響，CysC水平越高，提示腎臟受累程度越重[23]。A1M 是腎小管重吸收功能的標志蛋白，特異性好，正常情況下，尿中A1M 含量甚微，僅在腎小管損傷時排出明顯增加[24]。因此聯(lián)合觀察CysC 及A1M 對于判斷HSPN 早期腎功能的損傷更具有代表性。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)TGP 組患兒不僅治療總有效率明顯高于常規(guī)組，而且治療后血清CysC 及尿A1M水平較常規(guī)組下降更為明顯，提示加用TGP 治療HSPN 不僅臨床療效優(yōu)于常規(guī)治療，而且可能有改善腎功能的效果，對于其改善預后可能具有一定作用。

綜上所述，Tfh 細胞及IL-21、IL-4 共同參與了HSPN 的發(fā)病機制，而TGP 臨床療效較好，不良反應少，且可能通過對上述細胞及因子的調節(jié)作用從而在輔助治療HSPN 過程中發(fā)揮著重要作用。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突關系。